Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Özet

Bu rapor yüzey ekspresyonu, ulaşım yolları ve dışsal olarak ifade edilen, pH-duyarlı GFP-etiketli nöronların plazma membran proteinlerinin kaçakçılığı kinetik belirlemek için canlı hücre görüntüleme ve photobleach tekniklerinin kullanımı anlatılmaktadır.

Özet

Protokol

1. Hücre Kültürü, Viral Transdüksiyon ve Protein Ekspresyonu

1. In vitro (DIV) içinde 14-25 gün süreyle poli-L-Lizin-kaplı cam lamelleri üzerinde embriyonik günde 18 (E18) sıçan yavru kültüre yüksek yoğunluklu hipokampal nöronlar.
2. 6-24 saat önce canlı deneyleri, süper ekliptik pHluorin (SEP) ile etiketlenmiş ilgi membran proteini içeren zayıflatılmış Sindbis virüs iletiminde hücreler.
3. Şartlandırılmış ortam 1mL içeren coverslip doğrudan psödoviriona-içeren orta ekleyin ve kültür inkübatöre geri. Viral iletimi sonrasında protein ekspresyonu için titre ve zaman virüs toplu bağlı olarak değişir ve önceden canlı hücre deneyler başlamadan her parti için belirlenmelidir.

2. FRAP-FLIP Canlı Hücre Görüntüleme

1. Ekipman set-up
   1. Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokal mikroskop görüntüleme odasına coverslip aktarın.Görüntüleme sırasında güç dalgalanmaları en aza indirmek için, mikroskop görüntüleme önce en az 20 dakika,% 100 lazer çıkışı ile açıldıktan sağlamak.
   2. Derhal, önceden ısıtılmış ile kültür ortamı yerini (37 ° C) 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 15 mM glükoz, 1.5 mM _CaCI2, 1,5 mM _MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH değerine ayarlanır içeren hücre dışı kayıt solüsyonu NaOH ile 7.4 ') ve Zeiss Axiovert arasında önceden ısıtılmış aşama (37 ° C) üzerine haznesi yerleştirin.
      
      Ekstraselüler kayıt çözeltisi osmolarite da kültür ortamı içinde 10 mOsm sağlamak üzere ayarlanmaktadır. Anlamlı buharlaşma deney timecourse sırasında oluşur kaydıyla, bu CO ₂ bağımsız çözüm kısa deneyleri (<10 saat) için uygundur. 1-2 mM sodyum bikarbonat ile ilave tavsiye edilir.
2. Görüntü yakalama parametreleri tanımlama
   1. İlk olarak, rekombinant pro ifade Bir nöron tanımlamakilgi protein ve de odak noktası haline getirmek.
   2. Bir 63X yağ itiraz, düşük güçte lazer 488nm lazer ışığı uyarım kullanarak tüm hücre bir görüntü kazanır. Photobleaching en aza indirmek için, toplam tarama hızı <1 saniye tutarak hızlı bir nominal hızının (7-9) ve düşük piksel çözünürlüğü (512-512) kullanın.
   3. ROI (~ 1.5-2.5 x optik zoom) içeren bir çerçeve yakalamak için resim ve yakınlaşma için dendrit bir kısmını seçin. Mümkün olan yerlerde, spesifik olmayan nedeniyle kazanım oluştuğu için photobleaching olup olmadığını belirlemek üzere, referans dendritler gelen ölçümler elde edilebilir, böylece görüş alanını içeren çeşitli işlemler sağlar.
   4. Filtreleri, iğne deliği, tarama hızı ve minimal lazer uyarılma ile ancak sınırlı doygunluğu ile maksimum floresans dedektör kazanç sağlamak için ayarlayın. Büyük bir iğne deliği çapı (2μm dikenleri ve üçlü dendritler için uygundur) foton toplama maksimize etmek, tavsiye edilir. Dedektörü kazanç, küçük floresans artışlarla algılayacak kadar güçlü olmalıdırphotobleaching önce ilk görüntüleri, doymuş piksel% 10 üstesinden olmadığı gibi.
   5. Önceden / post-ağartıcı ve deney geri kazanım aşamaları için kullanılmak üzere bu yapılandırma kaydedin.
   6. Sonraki photobleach bölgelerin tanımlanması; sonraki tekrarlanan photobleaching aşaması için ilk photobleach ve komşu bölgeleri için bir yatırım getirisi seçerek. Komşu bölgeleri tarama (genellikle 5 mikron, bkz. 2) arasındaki difüzyon ile kurtarma önlemek için yeterince geniş olduğundan emin olun.
   7. Photobleach İB'leri hem çamaşır suyu parametreleri ayarlayın. İlk photobleach optik yakınlaştırma ve ROI hacmine bağlı olarak, 1-5 yinelemeler arasında gerektiren hızlı (0.1-0.5 sn) olmalıdır. Taarruzcu bölgeleri için, lazer eksitasyon taarruzcu bölgelerin sürekli photobleaching sağlamak için ayarlanabilir ancak fototoksik zarar vermeden edilmelidir.
   8. Bir kılavuz olarak, tekrarlayan photobleaching ph% 100 lazer ilk photobleach için uyarma ve% 10 kullanınase.
3. Görüntü edinimi
   1. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, aşağıda 4 blok belirtilen bir değişken zaman aralıklı görüntü sırası olarak FRAP-FLIP deneyi gerçekleştirmek:
      
      BLOK 1: 3-10 önceden çamaşır suyu bazal görüntüleri, düşük lazer gücü de, hiçbir zaman gecikmesi
      BLOK 2: Photobleach tam lazer güçte santral yatırım getirisi, 1-5 yineleme
      BLOK 3: 3-10 post-ağartıcı kurtarma görüntüleri
      4 BLOK: 1 tipik bir zaman aralığında görüntü yakalama ile orta güçte lazer bölgeleri kuşatan tekrarlayan photobleach - 5 saniye, soruşturma altında protein toparlanma hızına bağlı.
   2. Sonuç olarak, 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 15mm glükoz, 1.5 mM _CaCI2, 1,5 mM _MgCl2, 20-25 mM MES (floresans gidermek için) ya da 50 mM ile tamamlanır içeren PH6 azından tamponlu kayıt çözeltisi ile hücre dışı kayıt çözeltisi yerine NH4Cl 90 mM NaCl, 5 mM KCI, 15 mM glükoz, 1.8 mM _CaCl2, 0.8 mM içeren_MgCl2, 20-25 mM HEPES, pH7.4 (düşük pH intraselüler mağazalarda proteinleri ortaya çıkarmak için), (bakınız Şek. 2).
   3. Istatistiksel analiz sağlamak için, her rekombinant protein için en az 10 ila 20 veri setleri toplayın. Önyargı sonuçları önlemek için, emin görüntüleme koşulları çoğaltır tutarlı korunur. Herhangi bir veri eksik ağartma, önemli bir odak düzlemi sürüklenme veya fototoksik hücre hasarı görülür kümeleri atın.

3. Veri Analizi

1. ImageJ yazılımı ile görüntüleri açın.
2. Stackreg eklenti (eklentiler → stackreg → dönüşümü ile zaman serisi boyunca oluşmuş olabilir xy düzleminde küçük dalgalanmaları hesaba yığınları Hizala: katı cisim → ).
3. Zeiss konfokal çekilen görüntüler için, bir metin dosyası olarak zaman değerleri (eklentiler → EKK Araç → göster EKK Toolbox rapor etmek EKK Araç eklenti kullanmak → → )ve bir analiz elektronik tabloya bu değerleri aktarmak.
4. FRAP-FLIP deney sırasında floresans dalgalanmaları ölçmek için, bireysel piksel bölgeler (~ 20pixels) içine photobleached kesimi bölmek ve her zaman noktası (F) bu İB'nin ortalama floresan ölçmek. Hızlı bir şekilde bu değerleri elde etmek için, ImageJ YG'ni Yöneticisi 'analiz aracı (→ Araçlar → YG Müdürü Analiz) kullanarak birden İB'leri seçin ve' Arsa Z ekseni profili 'komutu (kullanarak piksel başına ortalama floresan rapor Görüntü → Yığınları → Arsa Z eksen profil).
5. Bir arka plan, olmayan floresan bölgenin floresan yoğunluğu ölçmek için bu adımı yineleyin.
6. Deneysel gürültü çıkarmak ve ortalama öncesi ağartılmış temel ölçü bütün değerleri bölmek için plan değerleri çıkarılarak her noktada floresan Normale.
7. Spesifik olmayan düzeyini değerlendirmek için bitişik olmayan photobleached dendritlerin floresan ölçünedinimi sırasında photobleaching. Non-spesifik photobleaching için düzeltme 'FRAP-FLIP' verilerin yorumlanması için tavsiye edilmez ve mümkün olduğu kaçınılmalıdır.
8. Belirgin bir iyileşme ROI yer almıştır eğer hesaplamak için, ilk 5-10 önlemler (mesafe kadar taşınmış) ortalama gelen dizinin son 5-10 önlemlerin ortalama çıkarma ve istatistiksel anlamlılık belirler. Ekzositoz paterni (yani ekzositoz noktaları veya omurga vs mili kurtarma) değerlendirmek için kurtarma ve sivil kurtarma İB'leri sınıflandırır.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Tipik FRAP-FLIP deneyinin sonuçları Şek. 2. Burada, Eylül ile etiketlenmiş AMPA tipi glutamat reseptörü, bir alt birim GluA2 ifade Bir nöron seçici dendrit bir bölge boyunca photobleached edilmiştir. Şekil 2.A görüntülendi ve (beyaz kutu bölgeleri) photobleaching için seçilmiştir İB'leri işaret edilmiştir dendrit bölgesini göstermektedir. The büyük beyaz kutulu alan çift başlı mavi oklar ile vurgulanan yan kutulu bölgeler, ağartma tekrarlanan ardından, bir kez beyazlatılmış edildi. Kırmızı ok alt paneller yüksek büyütme gösterilen ölçülen yatırım getirisini gösterir.

Şekil 2.B, deney süresi boyunca ölçülen ROI olarak floresans yoğunluğunu göstermektedir. Bu örnekte, bir dakika süre geri kazanım ağartılmamış reseptörleri yanal difüzyonu yoluyla ROI girmesine izin vermek için ilk photobleach sonra kaydedilmiştir. Komşu bölgeleri photobleached zaman, reseptörler bu son derece hareketli fraksiyonu floresans sinyal merkezi bölgeden tıkalı olup, bölge içinde olanlar dışarı seyreltilir. 'FLIP' dizisi içinde gözlenen floresans (mesafe kadar taşınmış) artış dolayısıyla dendritik mili SEP-GluA2 yerleştirilmesi atfedilebilir. Düşük pH yıkama ve pH 7.4 '+ NH4Cl Ayrıca, sırasıyla ölçülen floresans yüzeyi elde edilir teyitÖlçülen ROI içinde hücre içi, sekestre proteinlerin oranı proteinleri ve ortaya koymaktadır.

FRAP aksine, bu metodoloji photobleached bölgede floresans iyileşme bir büyük ölçüde azaltılmış seviyesi ile sonuçlanan, nedeniyle ekzositoz için geri kazanım izole eder. Güvenilir bir matematiksel model Bugüne kadar uygun ve kurtarma bu seçici beyazlatma tekniği kullanılarak kaydedilen izleri analiz etmek için geliştirilmiştir. Bir mono üstel kurtarma ile kurtarma iz sığdırmak için, ancak mümkündür:

F _(t) = A _s - A ₀ e ^{(-t / τ)}

F _(t) t zamanında floresans olduğunda, A _s, kararlı bir değerdir A ₀ 0 zamanında offset, τ sabit zamanı. Kurtarma büyüme ekleme ve difüzyon arasındaki istikrarlı bir duruma tekabül bir dengeye ulaşmak için belirli bir oranı ile sabittir. Önemli olarak, zaman sabiti bu ekstrakteANALİZ ekzositoz sabiti zaman yansıtmıyor ve yalnızca tek bir protein için karşılaştırmalı tedavisi için de kullanılabilir.

Dahası, floresans iyileşme beklenen desen photobleached bölge boyunca alt etki gözlenmiştir olasıdır. Bir photobleached segmenti içindeki küçük ROI analizi ekzositoz "noktaları" ortaya çıkarmak için gerekli olabileceği ve bu hesaplanan oranı etkileyecek dendrit arasında bu lekelerin yoğunluğu değişkenliği gibi karşılaştırılabilir uzunlukları bölgeleri analiz etmek önerilir.

Şekil 3, görüş alanı içinde birden çok dendritler ile büyük bölümü Getirisini photobleach uygulayarak Bu protokolün bir uzantısı gösterir, sadece tek bir dendrit ağartma seçici tekrarlanan izledi. Bu yaklaşım geleneksel 'FRAP' ve paralel olarak elde edilecek 'FRAP-FLIP' veri sağlar. Bu örnekte, hipokampal nöronlar kainat sınıfının bir glutamat reseptör subunit ile enfekte olmuştur; GluK2 SEP-etiketli. Priogörüntüleme için r, bu nöronlar-edildi protein sentezini bloke etmek cylcohexamide (200μg/ml az 2 saat) ile muamele edilir. Ilgili ölçülen İB'leri (Şekil 3.B) böyle, floresan kurtarma 'FRAP-FLIP' protokolü maruz dendrit yalnız standart FRAP dendrit karşı geri dönüşüm lateral difüzyon ve geri dönüşüm nedeniyle iyileşme oranı görüldüğü gibi. FRAP karşı 'FRAP-FLIP' kurtarma eğrileri, geri dönüşüm göreli katkıları (mesafe kadar taşınmış _rec = 11.05%) ve (mesafe kadar taşınmış _fark =% 9.35) difüzyon lateralden mesafe kadar taşınmış değerleri karşılaştırarak varılabilir. Şekil 2 aksine, kurtarma protein sentezinin inhibisyonuna bağlı olarak istikrarlı bir devlet düzeyinde değil, korumak değildir, gösterir kullanılabilir reseptör havuzu (gözlenen yaklaşık% 20 düşüş tükenmesi için geçici bir artış ve buna karşılık gelen, sinyal açılan kapatma sonraki kayıt dönemi boyunca).

Şekil 1. Bu şematik SEP-tagged reseptörleri kullanarak, bir 'FRAP-FLIP' protokolü karşı düzenli FRAP sonuçlarını göstermektedir FRAP vs FRAP-FLIP protokol müdürleri şematik. Geleneksel FRAP floresans kurtarma sol tarafta gösterilir. Merkez ROI ölçülen floresan kurtarma, geri dönüşüm ve / veya dendritik mile de novo ekzositoz yoluyla photobleached YG ve reseptörlerinin ekleme dışından yanal difüzyon f olmayan photobleached EYL-etiketli reseptörlerinin bir arada atfedilir. Buna karşılık, sağ tarafta gösterildiği kuşatan İB'nin tekrarlayan photobleached gösterir nasıl yanal difüzyon nedeniyle bu modifiye 'FRAP-FLIP' protokolü sessizlikleri kurtarma. Bunun gibi, herhangi bir ölçülen floresan kurtarma ROI doğrudan ekleme atfedilebilir.

Şekil 2.Dendritik mil üzerinde plazma zarı içine SEP-GluA2 yerleştirilmesi

A) SEP-GluA2 dile getiren bir hipokampal nöron, seçici dendrit bir bölge boyunca photobleached. Sol üst paneli photobleaching için seçilmiştir İB'leri vurgular ederken şematik, görüntülenmiştir edilmiştir dendrit bölgesini göstermektedir. Büyük beyaz kutulu alan çift başlı mavi oklar ile vurgulanan yan kutulu bölgeler, ağartma tekrarlanan ardından, bir kez beyazlatılmış edildi. Bu panel photobleaching öncesinde dendrit gösterir. Kırmızı ok alt paneller yüksek büyütme gösterilen ölçülen yatırım getirisini gösterir. B) Deney süresi boyunca ölçülen yatırım getirisi ile floresans şiddeti, ROI gri düzeyi (normalize değil) olarak çizilmiştir gösterir. Siyah ok ilk photobleach ve yeşil ok timepoint vurgulamak tekrarlayan photobleaching başlangıcını belirtir. Mesafe kadar taşınmış inci gösterirdendritik mile SEP-GluA2 yerleştirilmesi nedeniyle kurtarma dönemde gözlenen floresans e artış. Müteakip düşük pH ve pH 7.4 + _NH4CI yıkar kurtarılan floresans ifade reseptörleri yüzey ile ilgilidir onaylayın.

Şekil 3. Cyclohexamide tedaviyi takiben dendritik şaft üzerinde Geri Dönüşüm ve SEP-GluK2 lateral difüzyon vs Geri Dönüşüm

A) hipokampal nöron paralel FRAP ve ayrı dendritik İB'leri birlikte gerçekleştirilen 'FRAP-FLIP' kurtarma protokolleri ile seçici photobleached SEP-GluK2, ifade. Bu nöron protein sentezi (200 mg / ml az 2 saat) engellemek için cyclohexamide ile ön tabi oldu. Şematik sol paneli photobleaching için seçilmiştir İB'leri vurgulayarak, görüntülenmiştir edilmiştir dendrit bölgesini göstermektedir. The büyük beyaz kutulu alan çift başlı mavi oklar ile vurgulanır alt dendrit sadece bir yan kutulu bölgeler, ağartma tekrarlanan ardından, bir kez beyazlatılmış edildi. Bu panel öncesinde photobleaching için dendritler gösterir. Kırmızı oklar 'FRAP-FLIP' protokolü karşı geleneksel FRAP içinde floresans toparlanma gösteren B yüksek büyütme gösterilen ROI) vurgulayın. Iyileşme geç evre (üçüncü panelleri) floresans şiddet seviyelerinde Karşılaştırmalar yalnız geri dönüşüm karşı yanal difüzyon ve geri dönüşüm katkısını göstermektedir. C) Deney süresi boyunca ölçülen İB'leri içinde floresans yoğunluğu, şiddeti normalize olarak çizilmiştir gösterir değerleri. Siyah ok ilk photobleach ve yeşil ok timepoint vurgulamak tekrarlayan photobleaching başlangıcını belirtir. Mesafe kadar taşınmış _rec FRAP / FLIP dendrit tespit reseptör geri dönüşüm nedeniyle geçici iyileşme gösterir iken mesafe kadar taşınmışdiff 'FRAP sadece' yatırım getirisi ile dendritik mile SEP-GluK2 lateral difüzyon katkısını ölçer. Geçici bir artışa cyclohexamide tedavisi bir sonucu olarak kullanılabilir reseptörlerinin çalıştırma aşağıya karşılık gelen sinyal kademeli azalma, takip eder. Sonraki düşük pH ve pH 7.4 + _NH4CI yıkar kurtarılan floresans ifade reseptörleri yüzey ile ilgilidir onaylayın.

Tartışmalar

Biz plazma membran proteini ticareti bileşenleri görselleştirmek için yenilikçi bir strateji tanımlamak. SEP-etiketli protein ile teknikleri photobleaching of Kombinatoryal yaklaşım plazma zarı ekleme olaylar değerlendirilmelidir seçici sağlar. Sürekli iyileşme sırasında bölgelere komşu olan membran proteinleri photobleaching olarak, 'FRAP-FLIP' yöntemi floresans kurtarma veziküler ticareti katkısını değerlendirir. Bu yeni yaklaşım belirlenecek kararlı durumda iyileşme gözlenir alt-bölme sayısı ve kurtarma (mesafe kadar taşınmış) genliği sağlayan proteinin membran ekleme doğrudan kayıt sağlar. Ayrıca, FLIP olan ve olmayan FRAP karşılaştırılması hesaplanacak yanal difüzyon kurtarma oranını atfedilebilir sağlar.

Dahası, aynı deney, taarruzcu photobleached bölgeleri bitişik olmayan photobleached dendrit bölgeleri olabilirniteliksel kurtarma sırasında değerlendirilir; bu bölgelerde gözlenen floresans kaybı dendrit bu non-photobleached segmente photobleached reseptörlerinin yanal difüzyon nedeniyle olacak.

Bu seçici photobleaching protokolü gibi (örneğin, dendritler ya omurga) veya paralel FRAP yaparak yanal difüzyon vs yerleştirilmesi katkı değerlendirilmesi ve 'FRAP tanımlandığı subareas plazma membranında excocytosis karakterize olarak hücresel ticareti işlemlerin çeşitli araştırmak için yararlanılabilir bitişik dendritler boyunca-FLIP 'protokolleri (Şekil 3).

Özel yönergeler sunulmuştur ise Açıkçası, her laboratuar spesifik örnekler ve ekipmanları göre görüntüleme parametrelerini optimize gerekir. Önemlisi, ROI tüm yüzey reseptörleri, photobleached z ekseni odak düzlemli bağımsız, fakat önemli fototoksik hasar veya spesifik olmayan photobleaching olmadan gerekir. BizeHücre soma bu protokol çalışırken ers nispeten düşük pH içi genellikle bölümlerinde bu bölgelerde yüksek eşiğe sonuçları yüksek yüzdesi olarak, dikkatli olmalıdırlar. Ayrıca, önceden üzerinde seçici bir photobleaching deney başlamadan, şekillerde değişir bu teknikte uygulanabilir nasıl göstermiştir iken, yeni bir Eylül-etiketli yapı, bu reseptörler etiketlenmiş bir başlangıç ​​karakterizasyonu birinci Ashby ve arkadaşları tarafından açıklanan şekilde, biçimde ifa edildiği hususu tavsiye ^2.

Genel olarak, bu yöntem yakın gerçek zamanlı olarak değerlendirilmek üzere plazma membranında ekleme olaylar sağlayan, standart FRAP protokol güçlü ve çok yönlü bir uyarlamasıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
24mm cam lamelleri	VWR International	631-0161
Poli-L-Lizin	Sigma	P2636
Neurobasal Orta	Invitrogen	21103
B27	Invitrogen	17504-044	2 nöronal kaplama konusunda% ve orta beslenme
Penisilin Streptomisin	Sigma	P0781	1 nöronal kaplama konusunda% ve besleme orta
L-Glutamine	Invitrogen	25030
At Serum	Biosera	DH-291H
PSIN ReP5 klonlama vektörü	Invitrogen	K75001	Sindbis virüs üretimi için
LSM510 META konfokal sistemi	Zeiss
Görüntü J Yazılım	NIH		Açık erişim yazılımı. Burada açıklanan tüm eklentileri temin edilebilir Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/