نماذج من الانبثاث العظام

Summary

وكثيرا ما يستخدم نماذج حيوانية لدراسة الانبثاث السرطان إلى العظام. في هذا البروتوكول سنقوم بشرح طريقتين مشتركة من التلقيح الورم ورم خبيث العظام للدراسات ووصف بإيجاز بعض التحليلات المستخدمة لرصد وقياس هذه النماذج.

Abstract

الانبثاث العظام هي أمر شائع في العديد من الأورام الخبيثة، بما في ذلك الثدي والبروستات، والرئة. متى تم انشاؤه في العظام، والأورام هي المسؤولة عن قسط كبير من المراضة والوفيات ^1. وبالتالي، هناك حاجة كبيرة لفهم الآليات الجزيئية السيطرة على إنشاء ونمو ونشاط الأورام في العظام. وقد وضعت عدة نماذج في الجسم الحي لدراسة هذه الأحداث ولكل منها فوائد معينة والقيود. النموذج الأكثر شيوعا يستخدم التلقيح داخل القلب من الخلايا السرطانية مباشرة في إمدادات الدم الشرياني من الفئران (عارية) athymic جرذان. ويمكن تطبيق هذا الإجراء إلى العديد من أنواع الأورام المختلفة (بما في ذلك PC-3 سرطان البروستاتا، وسرطان الرئة، والأورام الثديية الماوس وسادة من الدهون)، ولكن في هذه المخطوطة سنركز على الثدي نموذج السرطان، MDA-MB-231. في هذا النموذج نستخدم استنساخ للغاية العظام انتقائية، والمستمدة أصلا في مجموعة الدكتور موندي في سان انطونيو ^2، ح أنكما تقاس منذ ذلك الحين للتعبير GFP وإعادة استنساخ من قبل مجموعتنا ^3. هذا هو البديل استنساخ العظام النقيلي مع ارتفاع معدل osteotropism والانبثاث سوى القليل جدا لالكبد والرئة، أو الغدد الكظرية. في حين هي الأكثر شيوعا داخل القلب الحقن للدراسات الانبثاث العظام من ^2، في بعض الحالات intratibial ⁴ أو حقن الثدي الوسادة الدهنية هي أكثر ملاءمة. عادة يتم إجراء الحقن داخل القلب عند استخدام الخلايا السرطانية البشرية بهدف رصد مراحل لاحقة من ورم خبيث، وتحديدا من قدرة الخلايا السرطانية في العظام لاعتقال، البقاء على قيد الحياة، تتكاثر، وإقامة الأورام التي تتطور إلى مرض سرطان العظام التي يسببها. يتم تنفيذ الحقن Intratibial إذا التركيز على العلاقة بين الخلايا السرطانية والعظام بعد الورم قد انتشر إلى العظام، والتي يرتبط تقريبا أنشئت أمراض العظام النقيلي. أيا من هذه النماذج يلخص خطوات مبكرة في عملية المنتشر قبل الانسداد والدخولمن الخلايا السرطانية في الدورة الدموية. إذا رصد نمو الورم الابتدائي أو ورم خبيث من الموقع الأساسي إلى العظام، ثم الثديية التطعيمات منصة الدهون وعادة ما تكون المفضلة، ولكن عدد قليل جدا من خطوط الخلايا السرطانية تنتشر باستمرار والعظام من الموقع الأساسي، مع استنساخ العظام تفضيلية 4T1، ماوس الثديية سرطان، هو الاستثناء ^5،6.

هذه الإجراءات التلقيح مخطوطة التفاصيل والخطوات الرئيسية في التحليلات يسلط الضوء على آخر التلقيح. على وجه التحديد، فإنه يشمل زراعة الخلايا والأورام الخلية إجراءات التلقيح داخل القلب والتطعيمات لintratibial، فضلا عن معلومات موجزة فيما يتعلق بالرصد الأسبوعية عن طريق الأشعة السينية، مضان والتحليلات القياس النسيجي.

Protocol

1. خلية الصيانة

1. subclones العظام النقيلي العديد من MDA-231-MB توجد لديها الميل لمتغير الاستعمار العظام والنمو. لتجاربنا نحن نستخدم استنساخ المستمدة من GFP-231-الموسومة MDA-MB المتقدمة في UTHSCA ^2. وهذا فرعية معينة استنساخ تشكيل مرئية آفات عظمية في العظم ما يقرب من 3 أسابيع التلقيح آخر، مع التضحية في 4 أسابيع.
2. الحفاظ على خلايا في DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 0.1 ملغ / مل البنسلين الستربتوميسين-C ° 37 في 5-8٪ في ثاني ₂ ^7.
3. خلايا مرور في التقاء 80-90٪ وإعادة لوحة في التخفيف 1:10 (هذا يختلف تبعا لنوع الخلية وحجم لوحة. لMDA-MB 231-T الخلايا في هذا-75 حوالي 6x10 ^5)، والتي هو تقريبا كل ساعة 72.
4. MDA-MB-231 خلايا ليفية الحفاظ على مظهر عموما مع العديد من أقدام كاذبة. أي التقريب يدل على الضغط غير المرغوب فيها أو غيرها من الاكتظاظ، وينبغي تجنب هذا منذقد تؤثر المحتملة المنتشر في الجسم الحي.
5. من الناحية المثالية، ينبغي الحفاظ الخلايا في الثقافة لفترة وجيزة فقط قبل التلقيح (نوصي أقل من 1 أسبوع أو حتى يكون لديك ما يكفي من الخلايا للتجربة)، وينبغي إذابة قارورة جديدة إذا التقريب أو تغيرات في معدل نمو الخلايا تحدث.

2. خلية إعداد

1. يعرض للتريبسين الخلايا في التقاء 80-90٪ مع 0.15٪ التربسين / EDTA (تمييع 0.5٪ التربسين EDTA 01:02 Gibco في PBS). هذا التركيز يسمح لانفصال سريع (<2 دقيقة) ويقلل من التثاقل من الخلايا.
2. على الفور إزالة الخلايا من لوحة مع 10 مل من الجليد الباردة DMEM تحتوي على 10٪ FBS، ماصة في أنبوب مل المخروطية ال 15 وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
3. إعادة تعليق بيليه في أنبوب مخروطي 50 مل في 25 PBS الجليد الباردة مل (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) والعد.
4. الطرد المركزي لإعادة بيليه، و resuspend في 10 ⁶ خلايا لكل مل (داخل القلب) أو على ميكرولتر cells/10 250،000 (intratibial) في الجليد الباردة PBS. ودرجة حرارةتلح من PBS المهم لمنع تراكمها من الخلايا والانسداد اللاحقة بعد الحقن. ينبغي أن تظل الخلية التعليق على الجليد أثناء أداء الحقن وسوف تكون قابلة للحياة والبقاء بين الأمم المتحدة وتجمعت لمدة 30 دقيقة. في حين أن العدد الدقيق للوحات المطلوبة تختلف من محقق لمحقق، ونحن نستخدم عادة 1 T-75 للفئران بين 8-10.

3. التلقيح داخل القلب

1. 4-6 الاسبوع الإناث القديمة (NU-Foxn / -: هارلان) وتستخدم الفئران لهذه التجارب، على الرغم من غيرها من الفئران المناعة للخطر (RAG1 / -، RAG2 / -، SCID، XID، وغيرها) يمكن أن يكون أيضا استخدامها مع الإنسان تجارب الخلايا السرطانية.
2. يجب أن يكون الطعام الفئران عارية حمية 2920x أيام قبل حقن 5-10 Teklad لخفض وفيات من إجراء الحقن، والحد من مضان الخلفية في إجراءات التصوير (منذ البرسيم الغذاء مجانا).
3. إذا باستخدام الفئران غير نو / نو، وإزالة الشعر عن طريق الحلاقة أو استخدام ناير (ناير في تجربتنا تعمل على نحو أفضل) على بطني ع البطنعصام قبل بدء الإجراء.
4. تخدير الماوس في غرفة العزل باستخدام المرذاذ isoflurane (ايزو 2.5٪: 2-3 لتر / دقيقة O ₂₎ أو التخدير المفضل الأخرى (في تجربتنا isoflurane هو أفضل السكوت عن التطعيمات داخل القلب).
5. نقل أحد الماوس في وقت لمخروط الأنف من داخل الجهاز التخدير غطاء الفولاذ المقاوم للصدأ التهوية.
6. وضع كل الماوس على ظهرها مع الصدر لأعلى.
7. غسل الصدر مع مسحة البوفيدون / اليود 10٪ / حل تليها الايثانول 70٪، وتكرار 2 مرات.
8. علامة الماوس، الصدر للحقن (باستخدام علامة معقمة أو وضع علامات قليلا إلى الجانب للحفاظ على موضع الحقن المعقمة). نستخدم في منتصف الطريق بين مكان علامة الشق القصية وأعلى من عملية سيفي الشكل، واليسار قليلا (التشريحية) من القص. رسم فقاعة صغيرة من الهواء إلى حقنة لخلق مسافة بين المكبس والغضروف المفصلي (مهم لرؤية نبض القلب) من 300 غ من 28 ميكرولتر ½ حقنة الأنسولين، ووضع 100 ميكرولتر من الخلايا.
9. الحفاظ على الإبرة في وضع مستقيم. في حين عقد الجلد مشدود من الماوس مع جهة أخرى، أدخل الإبرة.
10. يجب الإدراج الناجح في البطين الأيسر في القلب يؤدي إلى نبض متميزة أحمر الدم في المحقنة. في هذا العمق، خفض المكبس من المحاقن بعناية (100 ميكرولتر حجم)، دون حركة كبيرة من الإبرة لتجنب ثقب في القلب أو خلايا يصب في تجويف الصدر.
11. بعد حقن الخلايا، سحب ما يصل قليلا على المكبس لخلق كمية صغيرة من الضغط السلبي للحد من نازف من الخلايا في تجويف الصدر.
12. سحب الإبرة مباشرة من الصدر بينما يجري التأكد من تجنب إمالة إبرة أثناء الإزالة، والتي يمكن أن تمزق بطانة القلب ويسبب النزيف.
13. تطبيق ضغط لطيف في الصدر أكثر من موضع الحقن للحد من النزيف.
14. إزالة الماوس من مخروط الأنف والاستمرار في تطبيق الضغط الخفيف لحوالي 1 دقيقة.
15. تحريك الماوس إلى سادة التدفئة حتى يخدع بالكاملscious.
16. إذا كان الماوس تبدأ في الدوران أو نشل بعد الشفاء، والسبب المرجح هو الانسداد. حقن الماوس intraperitonally مع 80-120 ملغم / كغم من الكيتامين لزيادة تدفق الدم والقلب الناتج، بينما تتناقص مقاومة الأوعية الدموية. وهذا من شأنه تمرير الماوس الجلطة. بعد حدوث ذلك، فمن الأفضل لتغيير الاستعدادات الخلية، لأنه يشير إلى أن الخلايا التثاقل. نغير الاستعدادات الخلية بعد حوالي 8 الفئران، أو 30 دقيقة.

4. Intratibial

1. حقن الفأر مع Buprenex (0.1 مجم / كجم) أو ما شابه ذلك وافقت على الفور مسكن قبل الإجراء.
2. تخدير الماوس باستخدام isoflurane، ثم نقل إلى مخروط الأنف والحفاظ على التخدير.
3. تنظيف ساقيه مع البوفيدون 10٪ / اليود مسحة / حل، تليها الإيثانول، وتكرار 2 مرات. الساقين يزيل الشعر (مع ناير أو منتج مماثل) قبل التنظيف الفراء إذا كان موجودا.
4. فهم بلطف الكعب الوحشي، الكعب الأنسي، والنصف السفلي من الساق مع السبابة والUMB، ثم ينحني الساق (مزيج من الانحناء والدوران الجانبي، على ان يكون مرئيا في الركبة ويمكن الوصول إليها.
5. الرطب الجلد مع EtOH 70٪ إلى زيادة وضوح الرباط الرضفي الكامنة، والتي يجب أن تكون مرئية بوصفه كيانا، خط، سميكة بيضاء. بينما يمسك بحزم الكاحل / الساق من إدراج الماوس 28G إبرة تحت الرضفة ½، من خلال الرباط الرضفي الأوسط من وإلى المنطقة الأمامية بين اللقمتين في أعلى الساق.
6. عند إدراج إبرة في الساق، الدليل بعناية من خلال لوحة النمو المطرد باستخدام وضغط العمل مع شركة الحفر طفيفة.
7. على الاختراق من لوحة نمو عظام الساق، سوف تواجه مقاومة الإبرة أقل بشكل ملحوظ.
8. استخدام لطيف، الحركة الجانبية للإبرة لضمان الإبرة في الساق ومن خلال لوحة النمو. وستقتصر الحركة إذا الإبرة في المكان المناسب داخل الساق.
9. خفض ببطء الغطاس لحقن 10 ميكرولتر من حل الخلية. يجب أن يرى شيئا يذكر لولا المقاومة في هذه المرحلة.
10. سلوفاكيااستخراج إبرة wly.
11. باتباع نفس الإجراء، انتقل إلى المرحلة التالية لحقن 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
12. إزالة الماوس من التخدير والحفاظ على لوحة التسخين حتى استردادها.
13. رصد الفئران على مدى ساعة وحقن ال 24 المقبلة مع كل ساعة إضافية Buprenex 12 إذا الحيوانات لا تزال تظهر علامات الشدة.

5. التصوير دوام

1. التصوير وسيفيراز: أين ينبغي أن تستخدم للتطبيق، ابتداء من التصوير وسيفيراز 7 أيام بعد التلقيح ورم الخلية (على الرغم من ورم خبيث في معظم النماذج العظام، للكشف أقرب إلى يوم 14). يتم حقن الماوس الغشاء البريتونى مع 150 ملغ / كغ وسيفيرين، تخدير، وتصوير 8 دقيقة بعد الحقن باستخدام معدات IVIS ^8.
2. GFP التصوير: عادة، معربا عن GFP الأورام تبدأ في أن تكون للكشف حول 10-14 يوما لحقن intratibial و16-21 للتجارب داخل القلب باستخدام أجهزة التصوير المايسترو (CRI) ^9. لفترة وجيزة، هي تخدير الفئران مع isoflurane (3٪) وحافظت تحت التخدير من خلال مخروط الأنف في غرفة التصوير مايسترو. لخلايا EGFP، معربا عن موقعنا نستخدم مجموعة الأزرق تصفية (498 excitation/515 الانبعاثات لEGFP) في التعرض MS 500 في 10 نانومتر الخطوات.
3. Faxitron (الأشعة السينية): تؤخذ الأشعة السينية بدءا الأسبوعية بين يوم 7 إلى 14. وسوف تكون واضحة في الآفات النموذج داخل القلب في اليوم 21 وقبل أسبوع في حقن intratibial ^3. وكانت الشركة قد بياناتنا التصوير الشعاعي للفيفو السابقين والحية باستخدام Faxitron LX-60 ب 35 كيلو فولت لمدة 8 ثوان من التعرض.
4. التصوير الأخرى: سيتم طرائق التصوير يعتمد كليا على البحوث محددة. بالإضافة إلى الأساليب المذكورة أعلاه، يمكن أن يعيش الحيوان التصوير على أساس 3D الدقيقة التصوير المقطعي (μCT) و المجهري بوزيترون الانبعاثات الرسم السطحي (μPET)، وطرائق أخرى ^10،11 توفر معلومات قيمة.

6. الماوس النحر

1. يحتوي كل نموذج على دورة زمنية مختلفة قليلا. مع MDA-MB-231 زنزانة الفئران تصبح عادة دنفي أو مشلول بين 21 و 35 يوما وعادة حوالي اليوم 28 (IT حقن الفئران بين 21-28 يوما).
2. مرة واحدة الفئران العديد من الآفات التي تبدأ تطوير لاختراق العظام القشرية، وتصبح مشلول، أو يفقد بين 10-20٪ من وزن الجسم، تضحية كل الفئران في دراسة استخدام الكيتامين / زيلازين جرعة زائدة مع خلع عنق الرحم (أو غيرها من IACUC الأسلوب المعتمد).
3. إزالة العظام حاجة لمزيد من الدراسة وتخزينها في الفورمالين 4٪ مخزنة.
4. الفئران مع أورام الصدر هي علامة على وجود حقن غاب وينبغي استبعادها من الدراسة.

7. تحليل خارج الجسم

1. μCT: المسح في EtOH 70٪ يسمح للمعلمات الهيكلية والنسيجية التي يمكن قياسها على العينة نفسها العظام.
2. الكنتورية وفقا لتحليل تصميم التجارب الفردية والمعدات المتاحة ^10. تم الحصول على البيانات المتوفرة لدينا مع μCT Scanco 40 (12) القرار باستخدام ميكرومتر.
3. Histomorphometry: العينات النسيجية باستخدام أساليب عملية وصمة عار المفضل مع الهيماتوكسيلين / ⁷ يوزين

8. ممثل النتائج

بعد التلقيح داخل القلب أو intratibial من الخلايا السرطانية (الشكل 1) ويتم رصد الأشعة من الفئران الأسبوعية ومضان (أو التلألؤ). الآفات تصبح عادة واضحة من الأشعة السينية بين 2 و 3 في الأسبوع، في حين أنها قد تكون مرئية من قبل مضان والتلألؤ اعتبارا من الاسبوع 2، اعتمادا على نموذج (الشكل 2). آفات مرئية والثقوب السوداء في العظام، وتصبح أكثر وضوحا مع مرور الوقت (الشكل 3). وتم قياس كمية الآفات باستخدام الأشعة Metamorph تحليل وكميا باستخدام مضان المايسترو (CRI) التصوير اقتناء وبرامج التحليل. كما الآفات تبدأ في النمو والفئران تصبح في كثير من الأحيان دنفي. مطلوب التضحية عند الفئران قد فقدت بين 10-20٪ من وزن الجسم الأولي. حالة من يمكن الفئران تتغير بسرعة ويجب أن تراقب عدة مرات خلال اليوم. بين 3-4 أسابيع بدأت الفئران لسحب واحد أو كلا الأطراف الخلفية وضحت الدراسة بأكملها. أخذت الصور قبل التضحية. بعد جرعة زائدة التخدير، وقد تم جمع الدم لقياس علامات دوران العظام أو غيرها من العوامل. بعد خلع عنق الرحم، تم تجريد الجلد من الماوس والعظام ورفعه لتنظيف الجسم الحي التصوير السابقين (الشكل 3) والتي سوف تسمح للبؤر السرطانية التصور لا يقل عن 7 أيام في وقت سابق من تقنيات التصوير الجسم الحي. وضعت مرة واحدة تم الانتهاء العظام في أشرطة التصوير وصفت وتخزينها في الفورمالين لتثبيت وتجهيز النسيجية مزيد من التحليل أو μCT. تم إجراء Histomorphometry على عينات للإشارة إلى عبء الورم وBV / TV بعد تم تنفيذ μCT على الساق لتحديد كمية الدمار العظام (الشكل 4).

/ 4260/4260fig1.jpg "/>
الشكل 1. المناسبة موضع الحقن. مشاهدة radiographical بطني (A) من الصدر الماوس الكبار تظهر الموضع الصحيح من إبرة في الفضاء وربي ⁴ و إلى البطين الأيسر للالتلقيح داخل القلب. وتظهر معالم التشريحية مع الخطوط المتقطعة الأفقية على القص (المبينة باللون الأبيض). على الجلد الماوس، الشق القصية وعملية تكون بمثابة معالم سيفي الشكل، ويتم إدراج إبرة قليلا تبقى من القص. مشاهدة radiographical بطني (B) من الضلع الماوس الكبار تظهر الموضع الصحيح من إبرة في الساق القريبة، الانحياز بين اللقم. من وجهة نظر الأطراف وضعت غيض من إبرة وراء الأحدوبة الظنبوبية والعميق لوحة المشاشية. ويظهر الموقع المثالي للحقن بواسطة دائرة بيضاء.

الشكل 2. دوام نماذج الانبثاث العظام. تطور كاليفورنياncer الناجم عن أمراض العظام تظهر مع الأشعة السينية والصور GFP + الفلورسنت من الأورام في الجسم الحي من الحقن intratibial (A) والحقن داخل القلب (B).

الشكل 3. بالطبع وقت MDA-MB-231 داخل القلب صف نموذج الأعلى: تحويلة الصورة الحية تبين GFP مضان في اليوم 0، 14، 21، و 28 بعد الحقن داخل القلب من 231-MDA-MB. نلاحظ أن البؤر السرطانية في اليوم 14 مرئية فقط في الجسم الحي السابقين بعد إزالة الأنسجة اللينة. الصف السفلي: الصور الشعاعية المجراة سابقا من أفخاذ؛ فخذان نفس توضح آفات عظمية العظام. لاحظ أن الدمار العظام غير مرئية عادة حتى 3 أسابيع بعد الحقن في القلب.

الشكل 4. الكمي للعظم نقيلي GFP. تطور الورم كما تصور + بواسطة مايسترو السابقين فيفو التصوير من الطيبيAE على فأرة الحاسوب واضعة غير الورم (A) وماوس 4 أسابيع بعد الحقن داخل القلب من التعبير عن GFP MDA-MB-231 subclone (B). البؤر السرطانية ترتبط مجالات تدمير العظام كما هو موضح من قبل Faxitron (D) مقارنة العظام دون الورم (C). يتم تقديم البيانات الهيكلية والعظم المعدنية من القياسات microCT كصور 3D من العظام صحية (E) وعظم تأثير الورم (F) حيث يتم عرض مجالات تدمير العظام ومنطقة الفراغ. وينظر كذلك العظام والورم من التفصيل في الأقسام المناظرة الملون H & E النسيجي (G & H).

Discussion

دراسات أمراض العظام التي يسببها الورم تعتمد على النماذج الحيوانية العديد منها وهما أكثر شيوعا هي التطعيمات داخل القلب وintratibial. في كثير من الحالات داخل القلب هو الخيار الأفضل لدراسة الانبثاث العظام ل، إلا أنها لا تمثل عملية كاملة المتنقل، وينبغي من الناحية المثالية ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم
MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي البشرية	في الأصل، ATCC داخليا المستنسخة واختيار
DMEM	GIBCO	11885
PBS	Mediatech شركة	21-040-CV
FBS	أطلس البيولوجي	F-0050a
التربسين	GIBCO	15400
Faxitron	Faxitron
قائد فرقة موسيقية	CRI
μCT الماسح الضوئي	Scanco
عاري الفئران Athymic	هارلان	الثعلب نو - / -
المحاقن الأنسولين (300 ميكرولتر، و 28.5 جم)	بيكتون ديكنسون	309300
IVIS	الفرجار
المشع القوارض حمية	Teklad	2920x