מודלים של גרורות עצם

Summary

מודלים של בעלי חיים לעתים קרובות מנוצלים כדי ללמוד גרורות סרטן העצם. בפרוטוקול זה יתאר שתי שיטות נפוצות של חיסון ללימודי גידול גרור בעצמות ומתארים בקצרה כמה מהניתוחים מנוצלים כדי לעקוב ולכמת דגמים אלה.

Abstract

גרורות בעצמות הן תופעה נפוצה במספר גידולים ממאירים, כוללים סרטן השד, סרטן הערמונית וריאות. לאחר שהוקם בעצמות, גידולים אחראים לתחלואה ותמותה משמעותית ^1. לפיכך, יש צורך משמעותי להבנת המנגנונים המולקולריים השולטים בממסד, הצמיחה והפעילות של גידולים בעצמות. כמה במודלי ניסויים שהוקמו כדי לחקור את האירועים הללו וכל אחד יש יתרונות ומגבלות ספציפיים. המודל הנפוץ ביותר מנצל חיסון intracardiac של תאים סרטניים ישירות לתוך אספקת הדם העורקי של (עירום) עכברי BalbC athymic. הליך זה יכול להיות מיושם על סוגי גידולים שונים (כולל סרטן הערמונית PC-3, קרצינומה של ריאה, וגידולי כרית שומן חלב עכבר), ואולם, בכתב היד הזה אנו נתמקד במודל בסרטן השד, מד"א-MB-231. במודל זה אנו מנצלים שיבוט מאוד עצם סלקטיבית, נגזר במקור בקבוצתו של ד"ר מאנדי בסן אנטוניו ^2, כי hכמאז transfected לביטוי של GFP ומשובט מחדש על ידי הקבוצה שלנו ^3. שיבוט זוהי וריאציה גרורתי עצם עם שיעור גבוה של osteotropism וגרורות מעט מאוד לריאות, כבד, או בלוטת יותרת כליה. בעוד זריקות intracardiac הם נפוצים ביותר ללימודים של עצם גרור ^2, במקרים מסוימים זריקות כרית שומן ⁴ intratibial או חלב הן יותר מתאימות. זריקות Intracardiac מבוצעות בדרך כלל בעת שימוש בתאים סרטניים אנושיים במטרת ניטור שלבים מאוחרים של גרורות, במיוחד היכולת של תאים סרטניים למעצר בעצמות, לשרוד, להתרבות, ולהקים גידולים שמתפתחים למחלת עצמות מושרות בסרטן. זריקות מבוצעות Intratibial אם מתמקדים במערכת היחסים של תאים סרטניים ועצמות לאחר גידול שלח גרורות לעצמות, אשר עולים באופן גס למחלת העצם גרורתית הוקמה. אף אחד מהדגמים האלה חוזרים על השלבים מוקדמים בתהליך גרורתי לפני התסחיף והכניסהשל תאים סרטניים למחזור הדם. אם ניטור צמיחה עיקרית גידול או גרורות מהאתר הראשי לעצם, אז חיסוני כרית שומן חלב הם בדרך כלל מועדפים, עם זאת, מעט מאוד שורות תאי גידול באופן עקבי לשלוח גרורות לעצמות מהאתר הראשי, עם שיבוטי 4T1 עצם מועדף, עכבר חלב קרצינומה, להיות חריג ^5,6.

זה פרטי הליכי כתב יד חיסון וצעדים מרכזיים מדגיש בהודעת ניתוחי חיסון. באופן ספציפי, זה כולל תרבות תאים, נהלי חיסון לתאים סרטניים וחיסוני intracardiac intratibial, כמו גם מידע בנוגע לניטור שבועי קצר על ידי הצילום רנטגן, פלואורסצנציה וניתוחי histomorphometric.

Protocol

1. תחזוקת תא

1. subclones גרורתי בעצמות רבה של מד"א-MB-231 קיימים שיש נטייה משתנית להתישבות עצם וצמיחה. על הניסויים שלנו אנו משתמשים בשיבוט נגזר מGFP מתויג-מד"א-MB-231 שפותחו בUTHSCA ^2. -Clone משנה המסוים הזה יהווה נגעי עצם osteolytic גלויים בכ 3 שבועות לאחר חיסון, בקורבנות ב4 שבועות.
2. לשמור על תאים בDMEM המכיל 10% FBS ו פניצילין סטרפטומיצין 0.1 מ"ג / מ"ל על 37 מעלות צלזיוס ב5-8% CO ₂ ^7.
3. תאי מעבר במפגש 80-90% מחדש צלחת בדילול 1:10 (זה משתנה בהתאם לסוג התא וצלחת הגודל. למד"א-MB-231 תאים בT-75 הנה כ 6x10 ^5), אשר הוא בערך כל שעות 72.
4. מד"א-MB-231 תאים לשמור על מראה כללי fibroblastic עם pseudopodia רב. כל עיגול הוא מעיד על מתח לא רצוי צפיפות או אחר, ויש להימנע מזהעשוי להשפיע על פוטנציאל גרורתי בגוף חי.
5. באופן אידיאלי, יש לשמור על תאים בתרבית לזמן קצר בלבד לפני החיסון (מומלץ פחות מ 1 wk או עד שיש לך מספיק תאים לניסוי), ובקבוקון חדש צריך להיות מופשר אם עיגול או שינויים בקצב צמיחת תאים להתרחש.

2. הכנת תא

1. Trypsinize תאים במפגש 80-90% עם 0.15% טריפסין / EDTA (לדלל Gibco 0.5% טריפסין EDTA 01:02 ב PBS). ריכוז זה מאפשר ניתוק מהיר (<2 דקות) ומפחית clumping של התאים.
2. מייד להסיר תאים מצלחת עם 10 מ"ל קר כקרח DMEM המכיל 10% FBS, פיפטה לתוך שפופרת 15 מ"ל חרוטים וצנטריפוגה XG ב 200 למשך 5 דקות.
3. Resuspend גלולה בצינור חרוטים 50 מ"ל ב 25 מ"ל קר כקרח PBS (ללא Ca ומגנזיום) ולספור.
4. צנטריפוגה מחדש גלולה, וresuspend ב 10 ⁶ תאים למ"ל (intracardiac) או ב250.000 cells/10 μl (intratibial) ב PBS קר כקרח. טמפרהמכשור של PBS הוא חשוב כדי למנוע יצירת גושים של תאים ולאחר מכן תסחיף לאחר הזרקה. השעית התא צריכה להישאר על קרח בעת ביצוע זריקות ותהיה ברי קיימא ויישאר בלתי clumped למשך 30 דקות. אמנם המספר המדויק של צלחות הנדרשות משתנה מחוקר לחוקר, אנחנו בדרך כלל להשתמש 1 T-75 לבין 8-10 עכברים.

3. Intracardiac הרכבת החיסון

1. נקבה בת 4-6 שבועות (נו / Foxn -: הרלן) עכברים המשמשים לניסויים אלה, אם כי עכברים חיסוניים חלש-אחרים (RAG1-/ -, RAG2-/ -, SCID, XID, וכד ') יכולים להיות גם שימוש בניסויי תא סרטני אנושיים.
2. עכברי העירום צריכים להיות ימים האכיל Teklad 2920x דיאטה 5-10 לפני הזרקה כדי להפחית תמותה מהליך ההזרקה, ולהפחית את קרינת רקע בבדיקות הדמיה (מאחר שהמזון הוא אספסת חינם).
3. אם אתם משתמשים בעכברים אחרים מאשר נו / נו, הסרת שיער על ידי גילוח או שימוש יאיר (Nair בניסיון שלנו עובד טוב יותר) על ar בטן גחוןEA לפני תחילת הליך.
4. הרדם עכבר בחדר בידוד באמצעות מכשיר אידוי isoflurane (2.5% Iso: 2-3 ליטר / דקת O ₂₎ או הרדמה מועדפת אחרת (בניסיון שלנו הוא הטוב ביותר isoflurane נסבל עבור חיסוני intracardiac).
5. הזז את עכבר אחד בכל פעם לחרטום של מכונת ההרדמה בתוך מכסה מנוע מאוורר נירוסטה.
6. מקם כל עכבר על הגב שלו עם החזה כלפי מעלה.
7. שטוף את החזה עם 10% ספוגית povidone / יוד / פתרון אחרי אתנול 70%, חוזר 2 פעמים.
8. החזה של מארק העכבר להזרקה (תוך שימוש בסמן עקר או סימון מעט לצד כדי לשמור על אתר ההזרקה סטרילית). אנו משתמשים באמצע דרך בין סימן מיקום המעולה והעליון של תהליך xyphoid חזה, ומעט שמאלה (אנטומי) של עצם החזה. צייר בועה קטנה של אוויר לתוך מזרק כדי ליצור רווח בין הבוכנה ומניסקוס (חשוב לראות דופק לב) של 28 גרם 300 μl ½ מזרק אינסולין, ולצייר עד 100 μl של תאים.
9. שמור מחט זקופה. בעוד מחזיק עור של עכבר מתוח עם יד שנייה, הכנס מחט.
10. החדרה מוצלחת לתוך חלל לב שמאלי צריכה לגרום לדופק אדום בהיר ברור של דם במזרק. בעומק הזה, לדכא את הבוכנה של מזרק בזהירות (100 נפח μl), ללא תנועה משמעותית של המחט, כדי למנוע ניקוב לב או תאים נשפכים לתוך חלל החזה.
11. לאחר התאים מוזרקים, להרים מעט בבוכנה ליצירת כמות קטנה של לחץ שלילי כדי להפחית טפטוף של תאים לתוך חלל החזה.
12. משוך מחט ישירות מתוך חזה בעת היותו בטוח, כדי למנוע הטית המחט במהלך הסרה, שיכול לקרוע את הציפוי הפנימי של הלב ולגרום לדימום.
13. החל לחץ עדין על החזה מעל אזור ההזרקה להפחית את הדימום.
14. הסר עכבר מהחרטום ולהמשיך להפעיל לחץ על האור ל1 דקות.
15. הזז את העכבר לכרית חימום עד מלוא קוןscious.
16. אם העכבר מתחיל להסתובב או עווית לאחר התאוששות, הסיבה הסבירה היא תסחיף. הזרק עכבר intraperitonally עם 80-120 מ"ג / ק"ג של קטמין כדי להגדיל את זרימת דם ותפוקת לב, תוך כדי הקטנת התנגדות כלי דם. זה אמור לעזור לעכבר לעבור את הקריש. אחרי זה מתרחש, עדיף לשנות את ההכנות סלולריות, כפי שמצביע על כך שתאי clumping. אנחנו משנים את הכנות סלולריות לאחר כ 8 עכברים, או 30 דקות.

4. Intratibial

1. הזרק עכבר עם Buprenex (0.1 מ"ג / ק"ג) או משככי כאבים דומים אושרו מייד לפני ההליך.
2. הרדם עכבר באמצעות isoflurane, ואז לעבור לחרטום ולשמור על הרדמה.
3. נקה את שתי רגליים עם povidone 10% / יוד ספוגית / פתרון, ואחריו אתנול, חוזר 2 פעמים. רגליים להשיר שער (עם Nair או מוצר דומה) לפני הניקוי אם הווה פרווה.
4. עדינות לתפוס malleolus רוחבי, malleolus המדיאלי, וחיצו התחתון של עצם שוק באצבע והUMB, אז רגל עיקול (שילוב של כפיפה ורוטציה לרוחב, כך שהברך היא גלויה ונגישה.
5. הרטב את העור עם EtOH 70% להגדלת חשיפה של בסיס גיד פיקה, שאמורה להיות גלוי כקו ברור ועבה, לבן. בעוד תקיפות אחיזת קרסול / רגל של תותב עכבר 28g ½ מחט תחת פיקת ברך, באמצע של רצועת פיקה, ונכנס לאזור intercondylar הקדמי בחלק העליון של עצם שוק.
6. בעת הכנסת מחט לשוקה, להדריך בזהירות על צלחת צמיחה באמצעות לחץ קבוע, מוצק עם פעולת קידוח קלה.
7. עם החדירה של צלחת צמיחת שוקה, המחט תיתקל במידה ניכרת פחות התנגדות.
8. השתמש בתנועה עדינה, לרוחב של מחט כדי להבטיח מחט היא בשוקה ובאמצעות לוחית הצמיחה. התנועה תהיה מוגבלת אם המחט נמצאת במקום נכון בתוך שוקה.
9. לאט לדכא את הבוכנה להזריק 10 μl של פתרון תא. לא מעט התנגדות צריך להיות מורגש בשלב זה.
10. Slowly לחלץ מחט.
11. בעקבות אותו ההליך, המשך לקטע הבא להזריק 10 μl של PBS.
12. הסר עכבר מן ההרדמה ולשמור על כרית חימום עד התאושש.
13. פקח את העכברים מעל 24 השעות הבאות, ולהזריק כל 12 שעות עם Buprenex נוסף אם חיות ממשיכות להראות סימני מצוקה.

5. קורס זמן הדמיה

1. הדמית לוציפראז: איפה דימות רלוונטיות, לוציפראז צריכות להיות מנוצלות מתחילות ב 7 ימי חיסון תא לאחר גידול (אם כי ברוב הדגמים גרורים בעצמות, גלוי קרוב יותר ליום 14). עכבר מוזרק intraperitoneally עם 150 מ"ג / קילו luciferin, מורדם, וצלם 8 דקות לאחר הזרקה באמצעות IVIS ציוד ^8.
2. GFP הדמיה: בדרך כלל GFP-להביע גידולים מתחילים להתגלות סביב 10-14 יום לזריקות ו16-21 intratibial לניסויי intracardiac באמצעות מאסטרו הדמית ציוד (CRI) ^9. בקצרה, עכברים מורדמים עם isoflurane (3%) ונשמר תחת הרדמה דרך אף חרוט בחדר הדמית המאסטרו. לתאים שלנו eGFP מבטאים-אנו משתמשים בסט המסנן הכחול (498 excitation/515 פליטה לeGFP) בחשיפת 500 מילים ב 10 צעדי ננומטר.
3. Faxitron (X-ray): רנטגן נלקחים שבועי מתחיל בין 7 ימים עד 14. נגעים יהיו גלויים במודל intracardiac ב21 יום ושבוע קודם לכן ^ב3 זריקות intratibial. הנתונים רדיוגרפי לvivo לשעבר וin vivo נרכש באמצעות Faxitron LX-60 ב 35 kV במשך 8 שניות של חשיפה.
4. הדמיה אחרת: שיטות הדמיה תהיה מבוססת כולה על המחקר הספציפי. בנוסף לשיטות הנ"ל, הדמית חי המבוססת על מייקרו-3D טומוגרפיה ממוחשבת (μCT), טומוגרפיית פליטת פוזיטרוני מייקרו (μPET), ושיטות אחרות ^10,11 יכולה לספק מידע רב ערך.

6. קורבן מאוס

1. כל דגם יש כמובן זמן שונה במקצת. עם מד"א-MB-2עכברי 31 תאים הופכים לרוב cachectic או משותקים בין 21 ל 35 ימים ובדרך כלל סביב היום 28 (IT הזריק לעכברים שבין 21-28 ימים).
2. לאחר כמה עכברים לפתח נגעים שמתחילים לפרוץ את עצם קורטיקלי, הפך משותק, או לאבד בין 10-20% ממשקל גוף, להקריב את כל העכברים במחקר באמצעות מנת יתר של קטמין / xylazine עם נקע בצוואר רחם (או שיטה שאושרה IACUC אחרת).
3. הסר עצמות דרושות למחקר וחנות נוספים בנאגר פורמלין 4%.
4. עכברים עם גידולים בחזה הם סימן לזריקה והחטיאה יש הוצאו מהמחקר.

7. ניתוח Vivo Ex

1. μCT: הסריקה בEtOH 70% מאפשר לפרמטרים מבניים והיסטולוגית יש למדוד באותה דגימת עצם.
2. CONTOUR ולנתח לפי עיצוב ניסיון אישי וציוד זמין ^10. הנתונים שלנו הושגו עם Scanco μCT 40 מיקרומטר ברזולוציה 12.
3. Histomorphometry: דגימות תהליך באמצעות שיטות מועדפות היסטולוגית וכתם Hematoxylin / ⁷ Eosin

8. נציג תוצאות

בעקבות חיסון intracardiac או intratibial של תאים סרטניים (איור 1) עכברים מנוטרים שבועי ידי רדיוגרפיה ופלואורסצנטי (או הארה). נגעים בדרך כלל יתבררו על ידי x-ray בין השבוע 2 ו -3, בזמן שהם יכולים להיות גלויים על ידי קרינה והארה כבר בשבוע 2, בהתאם לדגם (איור 2). נגעים נראים כחורים אפלים בעצמות, והופכים בולטים יותר עם ​​זמן (איור 3). נגעים היו לכמת באמצעות ניתוח Metamorph של צילומי רנטגן ופלואורסצנטי כומתת שימוש (CRI) רכישת מאסטרו הדמיה ותוכנת ניתוח. כנגעים מתחילים לצמוח, עכברים לעתים קרובות הופכים cachectic. הקרבה נדרשת כאשר עכברים אבדו בין 10-20% ממשקל גופם הראשוני. מצבו של עכברים יכולים להשתנות במהירות וחייבים להיות במעקב מספר פעמים במהלך היום. בין 3-4 שבועות עכברים התחילו לגרור אחת או בשני גפיים אחוריים והמחקר כולו הוקרב. תמונות צולמו לפני להקריב. אחרי מנת יתר של חומרי הרדמה, דם נאסף כדי למדוד סמנים של מחזור עצם או גורמים אחרים. לאחר עקירת צוואר רחם, הופשט מעור העכבר והעצמות הוצאו וניקה עבור vivo לשעבר הדמיה (איור 3), שתאפשר הדמיה של מוקדי גידול לפחות 7 ימים מוקדם יותר מאשר בשיטות הדמית vivo. עצמות לאחר ההדמיה הושלמה הונחו בקלטות שהכותרת ומאוחסנות בפורמלין לקיבוע ועיבוד היסטולוגית נוסף או ניתוח μCT. Histomorphometry בוצע על הדגימות כדי לציין את ניטל הגידול וBV / טלביזיה לאחר μCT בוצע על שוקה לכמת את כמות הרס עצם (איור 4).

/ 4260/4260fig1.jpg "/>
איור 1. מיקום נכון של זריקה. נוף radiographical גחון (א) לבית חזה עכבר מבוגר מראה מיקום נכון של מחט בחלל בין הצלע ⁴ ובלתוך החדר השמאלי לחיסון intracardiac. נקודתי ציון האנטומיות מוצגות עם קווים מקווקווים אופקיים על עצם החזה (בקו לבן). על העור של עכבר חריץ חזה ותהליך xyphoid לשמש כציוני דרך, והמחט המוחדרת שמאלית של עצם החזה במקצת. נוף radiographical גחון (ב ') ברגל עכבר מבוגרת מראה מיקום נכון של מחט בשוקה הפרוקסימלי, מיושר בין condyles. מנקודת מבט רוחבי קצה המחט ממוקם מאחורי גבששת השוקה והעמוקה לצלחת epiphyseal. מיקום אידיאלי להזרקה מוצג על ידי העיגול לבן.

איור 2. כמובן זמן של דגמים גרורים בעצמות. התקדמות של CAמחלת העצם ncer מושרה מוצגת עם צילומים רנטגן וGFP + תמונות ניאון של גידולי in vivo מintratibial זריקות () וintracardiac זריקות (B).

איור 3. כמובן זמן intracardiac מודל שורת מד"א-MB-231 למעלה:. תמונת vivo לשעבר מראה GFP פלואורסצנטי ביום: 0, 14, 21, 28 ולאחר הזרקת intracardiac של מד"א-MB-231. שים לב שמוקדי גידול ב14 יום נראים רק בvivo לשעבר לאחר הסרת רקמות רכה. שורה תחתונה: תמונות רדיוגרפי vivo לשעבר של אותן femora ממחיש נגעי עצם osteolytic. שים לב שהרס העצם הוא בדרך כלל לא נראה לעין עד 3 שבועות לאחר הזרקה ולב.

איור 4. כימות של התקדמות. GFP גרורתי עצם + גידול כפי דמיין ידי מאסטרו הדמית vivo לשעבר של טיביםAE של עכבר שאינו נושאת גידול () ועכבר 4 שבועות לאחר הזרקת intracardiac של GFP להביע subclone מד"א-MB-231 (B). מוקדים סרטניים לתאם עם אזורים של הרס עצם, כפי שמוצגים על ידי Faxitron (ד ') בהשוואת עצם ללא גידול (C). נתונים מבניים ומינרלים בעצמות ממדידות microCT מוצגים כתמונות 3D של עצם בריא (E) ועצם נושאת גידול (F) שבו אזורים של הרס עצם מוצגים כאזור ריק. פירוט עצם וגידול נוסף נתפס בחטיבות מקבילות H & E מוכתמות ההיסטולוגיים (G & H).

Discussion

מחקרים על מחלות עצם גידול מושרה להסתמך על כמה מודלים של בעלי חיים אשר 2 הנפוצים ביותר הם חיסוני intracardiac וintratibial. במקרים רבים intracardiac היא האפשרות הטובה ביותר ללימוד גרורות לעצמות, אך היא לא מייצגת תהליך גרורתי המלא, ולכן כרית שומן חלב או זריקות orthotopic אחרות באופן אידיאלי י...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים
מד"א-MB-231 תאי סרטן שד אנושיים	מקור משובט ATCC-פנימי ונבחר
DMEM	GIBCO	11885
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
FBS	אטלס ביולוגי	F-0050a
טריפסין	GIBCO	15400
Faxitron	Faxitron
מאסטרו	CRI
μCT סורק	Scanco
עכברים בעירום Athymic	הרלן	פוקס נו - / -
מזרקי אינסולין (300 μl, 28.5 גר ')	הקיטון דיקינסון	309300
IVIS	Caliper
דיאט המכרסם מוקרן	Teklad	2920x