الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام الببتيد: MHC tetramers وmicrobeads المغناطيسي لعزل السكان التردد المنخفض من الخلايا T-حاتمة محددة وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. هذه الطريقة تمكن من الدراسة الذاتية المباشرة السكان خلية T من الاهتمام من في الجسم الحي أنظمة التجريبية.

Abstract

ضرورة أساسية للباحثين الذين يدرسون الحصانة التكيف مع نماذج تجريبية في الجسم الحي هو القدرة على تحديد الخلايا T T بهم على أساس خلية مستقبلة المستضد (TCR) خصوصية. العديد من الطرق غير المباشرة التي تتوفر في عدد سكانها ويتم تحفيز الخلايا T الأكبر من في المختبر مع مستضد معين وحاتمة محددة خلايا T وتحديدها من خلال قياس استجابة وظيفية مثل انتشار الأسلحة النووية، إنتاج السيتوكينات، أو التعبير عن علامات التنشيط ^1. ومع ذلك، هذه الأساليب تحديد حاتمة محددة فقط خلايا T واظهار واحدة من العديد من الوظائف المحتملة، وأنها ليست حساسة بما يكفي للكشف عن خلايا محددة حاتمة T على ترددات السلائف السذاجة. وثمة بديل شعبية هو المعدلة وراثيا TCR نموذج نقل بالتبني، والتي هي خلايا T المصنف حيدة النسيلة من الماوس المعدلة وراثيا في TCR المضيفين متوافق نسيجيا لخلق السكان السلائف كبير من الخلايا T-حاتمة محددة يمكن أن تكون EASIلي مع تعقب استخدام الأجسام المضادة علامة ^2،3 مسانج مشترك. بينما قوية، وهذه الطريقة يعاني من التحف التجريبية المرتبطة تردد من الخلايا T unphysiological مع خصوصية لحاتمة واحدة ^4،5. وعلاوة على ذلك، لا يمكن أن تستخدم هذا النظام للتحقيق في عدم التجانس الوظيفي للحاتمة محددة استنساخ الخلايا T للسكان من بولكلونل.

يجب أن الطريقة المثلى لدراسة الحصانة التكيف تنطوي على الكشف المباشر للحاتمة محددة خلايا T T من مرجع الخلية المحلية باستخدام أسلوب الذي يميز خصوصية TCR فقط من قبل ملزم لالمشابهة الببتيد: مجمعات MHC (PMHC). استخدام tetramers PMHC والتدفق الخلوي يحقق هذا ^6، ولكن يقتصر على الكشف عن السكان تيرة عالية من الخلايا T-حاتمة محددة لا توجد إلا مستضد التالية التي يسببها التوسع نسيلي. في هذا البروتوكول، ونحن تصف الطريقة التي تنسق استخدام tetramers PMHC وماغنيتيك تكنولوجيا تخصيب الخلية لتمكين الكشف عن خلايا T التردد المنخفض للغاية حاتمة محددة من الأنسجة اللمفاوية ^3،7 الماوس. مع هذه التقنية، يمكن للمرء أن تتبع شامل كامل حاتمة محددة من الخلايا T السكان الذاتية في الفئران في جميع مراحل الاستجابة المناعية.

Protocol

1. عزل الخلايا من الأنسجة اللمفاوية

1. إضافة 1 مل من الجليد الباردة cEHAA (+ 10٪ EHAA FBS، القلم / بكتيريا، جنتاميسين، 2 مم L-الجلوتامين، 55 مم 2-المركابتويثانول) أو غيرها من الخلايا T المتوسطة ما يعادلها، إلى صحن الثقافة 60 مم يحتوي على مربع صغير من 100 شبكة النايلون ميكرومتر ومكان على الجليد.
2. الموت ببطء الماوس.
3. إزالة الطحال والغدد الليمفاوية ما يصل يمكن الوصول إليها بسهولة ممكن. ينبغي أن تشمل هذه على الأقل، الإبطين الأربية، العضدية، والعقد اللمفاوية العنقية، والمساريقي. وضعها على رأس شبكة النايلون في طبق الثقافة.
4. باستخدام الأعلى المسطح من 1،5 أنبوب مغلق microfuge مل، الهريس بلطف الأنسجة اللمفاوية خلال شبكة من النايلون لتحرير الخلايا الليمفاوية. إضافة 1 مل من آخر cEHAA والماصة صعودا وهبوطا للعمل الخلايا في التعليق. نقل الخلايا من خلال قطعة أخرى من النايلون وضعت على شبكة أعلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل مادة البولي بروبيلين. شطف الأطباق وشبكة مع آخر 1 مل من الجليد الباردة cEHAA، صأولينغ وحدات التخزين في أنبوب واحد. تكرار لتحقيق التعليق الخلية النهائي حجم 4 مل.
5. إضافة الباردة العازلة فارز (PBS + 2٪ FBS، أزيد 0.05٪) إلى الحجم النهائي من 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C.
6. نضح بعناية طاف، والتأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في كتلة FC (فارز عازلة + 2.4G2 الضد) إلى وحدة تخزين النهائي يساوي تقريبا ضعف من بيليه نفسه. على سبيل المثال، الطحال والغدد الليمفاوية على فأرة الحاسوب ساذجة تنتج عادة بيليه خلية من حوالي 100 ميكرولتر. في هذه الحالة، إضافة 100 ميكرولتر من كتلة التيسير لتبرزي حجم إلى 200 ميكرولتر. إذا كان درجة كبيرة من التثاقل خلية حدث، وإزالة بعناية تتجمع الخلايا في هذه المرحلة مع طرف الماصة.

2. Tetramer تلوين

1. إضافة PE-APC-المسمى أو PMHC tetramer إلى تركيز النهائي من 10 نانومتر (أو تركيز الأمثل تجريبيا).
2. ومزيج incubaالشركة المصرية للاتصالات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (أو الوقت الأمثل تجريبيا ودرجة الحرارة).
3. إضافة الباردة العازلة فارز إلى حجم 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. الحفاظ على العينات على الجليد أو عند 4 ° C من الآن فصاعدا.
4. نضح بعناية طاف، والتأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في المخزن المؤقت فارز إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر. لتخصيب tetramer مزدوجة، إعادة تعليق النهائية إلى وحدة تخزين من 150 ميكرولتر.

3. المغناطيسية التخصيب

1. إضافة 50 ميكرولتر من microbeads Miltenyi مكافحة PE أو مكافحة APC. لتخصيب tetramer مزدوجة، إضافة 50 ميكرولتر من كل من.
2. خلط واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
3. إضافة الباردة العازلة فارز إلى حجم 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C.
4. أثناء انتظار، إعداد عمود LS Miltenyi المغناطيسي المغناطيس على MidiMACS أو QuadroMACS. وضع مفتوح البولي بروبلين 15 مل أنبوب الطرد المركزي علىرف مباشرة تحت العمود.
5. أضف 3 مل من العازلة فارز إلى أعلى العمود، والسماح لها لاستنزاف في أنبوب 15 مل.
6. وضع النايلون مساحة 100 ميكرومتر شبكة على رأس العمود.
7. عندما تنتهي من الخلايا الغزل ونضح بعناية طاف بيليه و resuspend في 3 مل من العازلة فارز.
8. نقل التعليق الخلية من خلال شبكة من النايلون على الجزء العلوي من العمود.
9. عندما توقف خلية استنزفت تماما في العمود، وشطف الأنبوب الأصلي مع آخر مل 3 من فارز العازلة ونقل المخزن المؤقت من خلال شبكة من النايلون في العمود، الشطف شبكة في هذه العملية. تجاهل شبكة النايلون.
10. عندما استنزفت تماما عازلة في العمود، إضافة آخر مل 3 من المخزن المؤقت فارز إلى العمود.
11. كرر الخطوة 10 لما مجموعه 3 مل يغسل X 3.
12. إزالة عمود من المغناطيس ومكان أكثر من أنبوب جديد 15 مل الطرد المركزي البولي بروبلين.
13. إضافة 5 مل من العازلة فارز لرانه العمود.
14. إدراج فورا الغواص في أعلى العمود في واحد وحركة مستمرة، ودفع المكبس على طول الطريق، مما اضطر العازلة من العمود في أنبوب.
15. أجهزة الطرد المركزي أنابيب تحتوي على جزء محدد مزال وجزء غير منضم التدفق من خلال لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C.
16. نضح بعناية طاف من الكسر محدد، مع التأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في المخزن المؤقت فارز إلى الحجم النهائي من 95 ميكرولتر بالضبط. نضح و resuspend الكسر غير منضم إلى الحجم النهائي من 2 مل.

4. تدفق الخلوي

1. لكل جزء، وإزالة وإضافة 5 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر من الخرز العد (معدلة لتركيز مل / 200،000 في المخزن المؤقت فارز) في أنبوب مل 5 FACS. توضع جانبا في 4 لتحليل C ° في وقت لاحق. لتوفير الوقت، يمكن الخرز مسبقا aliquoted لأنابيب المسمى قبل بدء التجربة.
2. إعداد صباحاأستر مزيج من الأجسام المضادة لعلامات وصمة عار على سطح الخلايا (الجدول 1). لتوفير الوقت، ويمكن أن يتم ذلك قبل بدء التجربة.
3. لجزء محدد، إضافة جرعة من الأجسام المضادة كوكتيل مباشرة إلى ميكرولتر من 90 ~ الخلايا في الأنبوب. إذا هو المطلوب تحليل الكسر غير منضم، بتحويل 90 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب 5 مل FACS وإضافة جرعة من الأجسام المضادة كوكتيل.
4. تشكيل لجنة للضوابط التعويض أحادية اللون لتدفق عداد الكريات. لكل ملون تألقي لاستخدامها، مزيج 50 ميكرولتر من الخلايا بقايا جزء غير منضم في أنبوب مل 5 FACS مع 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة CD4 مترافق إلى ملون تألقي المقابلة. تذكر لإنشاء عنصر تحكم غير ملوثين أيضا.
5. دوامة واحتضان جميع العينات لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
6. إضافة 5 مل من العازلة فارز لكل أنبوب الطرد المركزي ولمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C.
7. لجزء محدد، نضح بعناية طاف و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من BUF فارزFER. نقل الخلايا إلى microtube 1،2 مل FACS. شطف الأنبوب مع آخر ميكرولتر العازلة 200 من فارز والمسبح في نفس microtube. إذا كتل الخلايا واضحة، تمر الخلايا من خلال مرشح ميكرون 50.
8. لجزء غير منضم وضوابط التعويض، أو صب نضح طاف و resuspend في فارز 2 مل العازلة.
9. إعداد قياس التدفق الخلوي باستخدام عناصر التحكم التعويض أحادية اللون. حدد الجانب مبعثر ذات العرض (SSC-W) كمعلمة إضافية ليتم تسجيلها.
10. تحليل عينات الملون باستخدام سلسلة من البوابات إدراج المتعاقبة CD4 + لتحديد أو CD8 + T الخلايا كما هو موضح في الشكلين 1 و 2. لكسور محدد، جمع خلايا أكبر عدد ممكن بحد أقصى 2،000،000 مجموع الأحداث. لكسور غير منضم، وجمع 1000000 مجموع الأحداث. الحفاظ على معدل الاستحواذ في 3000 أو أقل الأحداث في الثانية الواحدة.
11. باستخدام إعدادات الجهاز نفسه، وتحليل عينات العد حبة. جمع 10000 مجموع الأحداث.
12. حفظ كافة البيانات في ملفات FCS.

5. تحليل البيانات

1. تحليل FCS ملفات البيانات لعينات العد باستخدام حبة FlowJo البرمجيات. مبعثر مؤامرة قدمها FITC ووضع بوابة أرونج عد حبات (أنظر الشكلين 1 و 2). تحديد العدد الإجمالي للعد الخرز الكشف عن في كل عينة. طرح من إجمالي عدد الأحداث التي تم جمعها لتحديد عدد الخلايا التي تم جمعها من الأحداث.
2. حساب العدد الإجمالي للجميع الخلايا في كل عينة باستخدام المعادلات المبينة في الإطار 1.
3. تحليل FCS ملفات البيانات لعينات الملون جزء محدد وغير منضم. إعداد سلسلة من البوابات إدراج المتعاقبة لتحديد اللمفاوية +، ^لو الجانبية مبعثر العرض، تفريغ، CD3 +، + CD4 CD8 + أو، tetramer + الخلايا التائية في كل عينة كما هو موضح في الشكلين 1 و 2.
4. مضاعفة العدد الإجمالي للخلايا في العينة من الترددات لكل من بوابات إدراج تستخدم لتحديد CD4 + tetramer+ + CD8 أو tetramer + الخلايا لحساب العدد الإجمالي للخلايا T-حاتمة محددة (الإطار 1).

النتائج

الشكل 1 يصور ممثل المؤامرات التدفق الخلوي من الطحال pMHCII المخصب tetramer وعينات من الفئران العقدة الليمفاوية السذاجة، بينما يصور الشكل 2 بيانات تمثيلية للتحصين الفئران سابقا مع الببتيد ذات الصلة + CFA. مسلسل الأحداث النابضة يزيل autofluorescent غير المرغوب فيها ...

Discussion

وtetramer PMHC تخصيب خلية مقرها طريقة التي قدمها هذا البروتوكول هو أداة قوية لدراسة حاتمة محددة خلايا T من الخلايا T الذاتية ذخيرة. استخدام tetramers PMHC تمكن الكشف عن خلايا T حاتمة محددة تستند مباشرة على قدرة TCRs لربط يغاندس PMHC وما شابه ذلك. إثراء يوفر مستوى من الحساسية بحيث يمكن ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE أو APC مترافق PMHC tetramer (أو متعدد القسيمات)	صنع من قبل المحقق، تم الحصول عليها من المعاهد الوطنية للصحة الأساسية tetramer، أو تم شراؤها من مصادر تجارية
مكافحة PE microbeads المغناطيسي مترافق	Miltenyi	130-048-801
مكافحة APC microbeads المغناطيسي مترافق	Miltenyi	130-090-855
الأعمدة LS المغناطيسي	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS أو المغناطيس QuadroMACS	Miltenyi	130-042-302 أو 130-090-976
الخرز خلية العد	الحياة تكنولوجيز	PCB-100