פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין מ In vivo מערכות ניסיוניות.

Abstract

צורך בסיסי לחוקרים הלומדים חסינות אדפטיבית עם במודלי ניסויי vivo הוא יכולת לזהות תאי T המבוססים על קולטן תא T אנטיגן (TCR) הספציפי. שיטות עקיפות רבות זמינות שבחלק ארי של אוכלוסיית תאי T היא מגורה במבחנה עם תאי T epitope ספציפי אנטיגן ספציפי ומזוהים באמצעות המדידה של מענה פונקציונלי כגון הפצה, ייצור ציטוקינים, או ביטוי של סמני הפעלה ^1. עם זאת, שיטות אלו רק לזהות תאי T ספציפיים epitope מציגים אחד מפונקציות אפשריות רבות, והם אינם רגישים מספיק כדי לזהות תאי T epitope ספציפיים בתדרים מבשרים נאיביים. אלטרנטיבה פופולרית היא מודל העברת מאמצת TCR המהונדס, שבו תאי T חד שבטיים מעכבר מהונדס TCR הם seeded לתוך מארחי histocompatible ליצור אוכלוסיית מבשר גדולה של תאי T epitope ספציפיים שיכול להיות easily מעקב עם השימוש בנוגדני סמן congenic ^2,3. אמנם חזק, שיטה זו סובלת מממצאי ניסויים הקשורים בתדירות לא הפיזיולוגית של תאי T עם ייחוד לepitope ^4,5 אחת. יתר על כן, מערכת זו אינה יכולה לשמש כדי לחקור את ההטרוגניות התפקודית של תאי T שיבוטי epitope ספציפיים בתוך אוכלוסיית polyclonal.

הדרך האידיאלית ללמוד חסינות אדפטיבית צריכה לערב זיהוי הישיר של תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר תא T אנדוגני בשיטה המייחדת את הספציפיות TCR אך ורק על ידי הכריכה לאותו מקור פפטיד: מתחמי MHC (pMHC). השימוש בtetramers pMHC וcytometry זרימה משיג זאת ^6, אך מוגבל לזיהוי של אוכלוסיות בתדירות גבוהה של תאי T epitope ספציפיים נמצאו התרחבות משובטת אנטיגן מושרה הבאה בלבד. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה שמתאמת את השימוש בtetramers pMHC וMagneטכנולוגיה להעשרת תאי טיק כדי לאפשר זיהוי של תאים מאוד נמוכים תדר epitope ספציפיים T מרקמות עכבר הלימפה ^3,7. בעזרת טכניקה זו, ניתן לעקוב אחר אוכלוסיות שלמות מקיף epitope ספציפיים של תאי T אנדוגני בעכברים בכל שלבי התגובה החיסונית.

Protocol

1. בידוד תא מרקמת הלימפה

1. הוסף 1 מ"ל של הקרח הקר cEHAA (2-mercaptoethanol EHAA + 10%, עט / סטרפטוקוקוס, gentamycin, 2 מ"מ L-גלוטמין, 55 מ"מ FBS) או בינוני תא אחר שווה ערך T, לצלחת התרבות 60 מ"מימ המכילה ריבוע קטן של רשת 100 מיקרומטר ניילון ומניח על קרח.
2. להרדים את העכבר.
3. הסר את הטחול ובלוטות לימפה כנגישות רבות ככל האפשר. אלו צריכות לכלול לפחות את הבלוטות מפשעתי, בית השחי, זרוע, בצוואר רחם, וmesenteric הלימפה. הנח אותם על גבי רשת הניילון בצלחת התרבות.
4. שימוש בגג השטוח של צינור microfuge סגור 1.5 מ"ל, בעדינות מועך את רקמת הלימפה מעל רשת הניילון לשחרור לימפוציטים. הוסף עוד מיליליטר 1 מתוך cEHAA וpipet למעלה ולמטה כדי לעבוד תאים להשעיה. העברת התאים דרך עוד פיסת רשת ניילון מונחת על גבי צינור צנטריפוגה פוליפרופילן מ"ל 15. יש לשטוף את הצלחת ואת הרשת עם עוד 1 מ"ל של הקרח הקר cEHAA, פוoling הכרכים לתוך אותו הצינור. חזור על פעולה כדי להשיג נפח השעית תא סופי של 4 מ"ל.
5. הוסף חיץ סדרן קר (PBS + 2% FBS, יזיד 0.05%) לנפח סופי של 15 מ"ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C.
6. בזהירות לשאוב supernatant, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend התא גלול ב Fc בלוק (סדרן חיץ + 2.4G2 נוגדנים) להיקף השווה לכ כפול מזו של הכדור עצמו סופי. לדוגמה, בלוטות הלימפה והטחול של עכבר נאיבי בדרך כלל מייצרות תא גלולה של 100 μl. במקרה זה, להוסיף 100 μl של בלוק Fc להביא נפח עד 200 μl. אם מידה רבה של clumping תא התרחשה, להסיר בזהירות את גוש התא בשלב זה עם טיפ pipet.

2. כתמי tetramer

1. הוסף PE-APC או כותרתו pMHC tetramer לריכוז סופי של 10 ננומטר (או ריכוז מותאם באופן אמפירי).
2. מערבבים וincubaטה לשעה 1 בטמפרטורת חדר (או זמן וטמפרטורה מותאמים באופן אמפירי).
3. הוסף חיץ סדרן קר לנפח של 15 מ"ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. שמור על דגימות קרח או ב 4 ° C מעתה והלאה.
4. בזהירות לשאוב supernatant, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend תא הגלול במאגר הסדרן לנפח סופי של 200 μl. להעשרת tetramer כפולה, resuspend לנפח סופי של 150 μl.

3. העשרה מגנטית

1. הוסף 50 μl של microbeads Miltenyi אנטי PE או אנטי APC. להעשרת tetramer כפולה, להוסיף 50 μl של שניהם.
2. לערבב ודגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C.
3. הוסף חיץ סדרן קר לנפח של 15 מ"ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C.
4. בזמן ההמתנה, להגדיר עמודה מגנטית Miltenyi LS על מגנט MidiMACS או QuadroMACS. מקם צינור פתוח 15 מ"ל פוליפרופילן צנטריפוגה עללצבור ישירות מתחת לעמודה.
5. הוסף 3 מ"ל של חיץ סדרן לראש הטור, מאפשר לנוזל להתנקז לתוך צינור המ"ל 15.
6. הנח ריבוע 100 מיקרומטר ניילון רשת על גבי העמוד.
7. כאשר תאים שסיימו ספינינג, לשאוב בזהירות את supernatant ו resuspend גלול ב 3 מ"ל של חיץ סדרן.
8. להעביר את השעית התא דרך רשת הניילון על החלק העליון של העמודה.
9. כאשר השעית התא אזלה לחלוטין בעמודה, יש לשטוף את הצינור המקורי עם 3 מ"ל נוסף של חיץ סדרן ולהעביר למאגר דרך רשת הניילון לעמודה, שטיפת הרשת בתהליך. השלך את רשת הניילון.
10. כאשר המאגר אזל לחלוטין לעמודה, להוסיף 3 מ"ל נוסף של חיץ סדרן לעמודה.
11. חזור על שלב 10 עבור סכום כולל של 3 3 כביסות x מ"ל.
12. הסר את העמודה מהמגנט והמקום מעל צינור חדש 15 מ"ל פוליפרופילן צנטריפוגה.
13. הוסף 5 מ"ל של חיץ סדרן לtהוא העמודה.
14. מייד להכניס את הבוכנה לתוך חלק העליון של העמודה ובתנועה רציפה אחת, דוחף את הבוכנה כל הדרך למטה, ואלץ את החיץ את הטור לשפופרת.
15. צנטריפוגה את הצינורות המכילים את שבר eluted הכבול וזרימה דרך השבריר המאוגד למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C.
16. בזהירות לשאוב supernatant מהשבריר הכבול, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend תא הגלול במאגר הסדרן לנפח סופי של בדיוק 95 μl. לשאוב וresuspend השבריר המאוגד לנפח סופי של 2 מ"ל.

4. זרימת cytometry

1. לכל שבר, להסיר 5 μl ולהוסיף עד 200 μl של חרוזי ספירה (מותאם לריכוז של 200.000 מ"ל / סדרן בחיץ) בצינור 5 מ"ל FACS. מניחים בצד ב 4 ° C לניתוח מאוחר יותר. כדי לחסוך זמן, חרוזים יכולים להיות מראש aliquoted לצינורות שכותרתו לפני תחילת הניסוי.
2. הכן amתמהיל אסתר של נוגדנים לסמני כתם שעל פני התאים (טבלה 1). כדי לחסוך בזמן, ניתן לעשות זאת לפני תחילתו של הניסוי.
3. לשבריר הכבול, להוסיף מנה של קוקטייל נוגדן ישירות ל~ 90 μl של תאים בצינור. אם ניתוח של השבריר המאוגד הוא רצוי, להעביר 90 μl של תאים לצינור 5 מ"ל FACS ולהוסיף מנה של קוקטייל נוגדנים.
4. הגדר את הפנל של בקרות פיצוי חד צבע לcytometer הזרימה. עבור כל fluorochrome לשמש, לערבב 50 μl של תאי שברים לא כרוכי שאריות בצינור 5 מ"ל FACS עם μl 1 של נוגדן מצומד לfluorochrome המקביל אנטי CD4. זכור להגדיר שליטת כתם גם כן.
5. מערבולת ודגירה כל הדגימות למשך 30 דקות ב 4 ° C.
6. הוסף 5 מ"ל של חיץ סדרן לכל צינור וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C.
7. לשבריר הכבול, לשאוב supernatant ו resuspend בקפידה את התאים ב200 μl של buf סדרןfer. להעביר את התאים לmicrotube 1.2 מ"ל FACS. שטוף את הצינור עם 200 μl אחר של חיץ סדרן וברכה לאותו microtube. אם גושים סלולריים הם לכאורה, עובר התאים דרך מסנן מיקרומטר 50.
8. לשבריר המאוגד ופקדי פיצויים, מזוג או לשאוב supernatant ו resuspend במאגר 2 מיליליטר הסדרן.
9. הגדרת cytometer הזרימה באמצעות פקדי הפיצוי חד הצבע. בחר צד פיזור רוחב (SSC-W) כפרמטר נוסף שיירשם.
10. נתח את הדגימות המוכתמות באמצעות רצף של שערי הכללה רצופים כדי לזהות CD4 + או CD8 + תאי T כפי שמודגם באיורי 1 ו 2. לשברים כפותים, לאסוף כמה שיותר תאים ככל האפשר עד למקסימום של 2,000,000 אירועים בסך הכל. לשברים לא כרוכים, לאסוף 1,000,000 אירועים בסך הכל. שמור את השיעור ברכישה או מתחת 3000 אירועים לשניים.
11. שימוש בהגדרות אותן מכונות, לנתח את דגימות חרוזי ספירה. לאסוף 10,000 אירועים כלל.
12. לשמור את כל הנתונים כקבצי FCS.

5. ניתוח נתונים

1. לנתח קבצי FCS נתונים לדגימות חרוזי הספירה באמצעות תוכנת FlowJo. פיזור עלילה קדימה על ידי FITC ונקבע שער aroung חרוזי הספירה (ראה איורי 1 ו 2). לקבוע את המספר הכולל של ספירת חרוזים שהתגלו בכל דגימה. לחסר ממספר הכולל של אירועים שנאספו על מנת לקבוע את מספר האירועים סלולריים שנאספו.
2. לחשב את המספר הכולל של כל התאים בכל דגימה באמצעות המשוואות שהותוו בתיבת 1.
3. לנתח קבצי FCS נתונים לדגימות השברים המאוגדות ולא מאוגדות המוכתמות. הגדר את רצף של שערי הכללה רצופים כדי לזהות + הלימפה, ^lo צד פיזור רוחב, מזבלה-, CD3 +, CD4 + או CD8 +, tetramer + תאי T בכל דגימה כמוצג באיורי 1 ו 2.
4. הכפל את המספר הכולל של תאים במדגם על ידי התדרים של כל אחד משערי ההכללה משמשים להגדרת סוג CD4 + tetramer+ או CD8 + + תאי tetramer כדי לחשב את המספר הכולל של תאי T epitope ספציפיים (תיבה 1).

תוצאות

איור 1 מתאר עלילות cytometry זרימה מייצגות של טחול pMHCII tetramer מועשר ודגימות הלימפה מעכברים נאיביים, בעוד איור 2 מציג נתונים יציגים לעכברים שחוסנו בעבר עם פפטיד הרלוונטי + CFA. gating הסידורי מסיר אירועים לא רצויים autofluorescent ואחרים מניתוח מהסוג CD4 + אוכלוסיות תאי T...

Discussion

שיטת pMHC tetramer מבוססת תא ההעשרה הוצגה על ידי פרוטוקול זה היא כלי רב עצמה ללימוד תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר התאים T אנדוגני. השימוש בtetramers pMHC מאפשר זיהוי של תאי T epitope ספציפיים המבוססים ישירות על היכולת שלהם להיקשר TCRs ligands pMHC מאותו מקור. ההעשרה מספקת רמת רגישות כך שאוכלוסי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE או APC מצומדת pMHC tetramer (או multimer)	תוצרת חוקר, המתקבל מליבת tetramer NIH, או נרכשו ממקורות מסחריים
Anti-PE microbeads המגנטי מצומדות	Miltenyi	130-048-801
Anti-APC microbeads המגנטי מצומדות	Miltenyi	130-090-855
טורים מגנטיים LS	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS או מגנט QuadroMACS	Miltenyi	130-042-302 או 130-090-976
חרוזי ספירת תאים	טכנולוגיות חיים	PCB-100