肽：MHC四聚体为基础的抗原表位特异性的T细胞的富集

摘要

此协议描述了使用的肽：MHC四聚体和磁性微珠分离低频表位特异性的T细胞群体，并通过流式细胞术分析它们。这种方法能够直接研究内源性T细胞群的兴趣

摘要

研究与体内实验模型的适应性免疫识别能力，根据他们的T细胞抗原受体（TCR）的特异性的T细胞的基本需要。许多的间接的方法是可在其中通过测量确定的官能反应，如增殖，细胞因子的产生，或活化标志物的表达的¹与特定的抗原和表位的特异性T细胞在体外刺激T细胞堆积人口。然而，这些方法只能识别特定表位的T细胞表现出的许多可能的功能之一，它们是不够敏感检测表位特异性的T细胞在幼稚前体频率。一种流行的选择是TCR基因转殖继转移模型，其中单克隆T细胞的TCR转基因小鼠接种到组织相容性的主机创建一个大的前体人口的表位特异性的T细胞，可以EASI光年跟踪与一个同类系的标记抗体^2,3使用。虽然功能强大，该方法遭受从实验与工件的非生理性T细胞的频率与一个单一的抗原决定簇特异性的^4,5。此外，该系统不能被用于研究的功能内的异质性的表位特异性的T细胞克隆的多克隆人口。

理想的方式来学习适应性免疫应包括使用的方法，区分TCR特异性完全由结合到同源肽：MHC（住房抵押贷款公司）的直接检测表位特异性T细胞的内源性T细胞库。住房抵押贷款公司的四聚体和流式细胞仪的使用来完成这^6，但被限制在检测高频只符合下列抗原诱导的克隆扩增的特定表位的T细胞群体。在这个协议中，我们描述了一种方法，协调使用的住房抵押贷款公司四和磁学抽动细胞富集技术，使极低频小鼠淋巴组织^3,7的特定表位的T细胞的检测。利用这种技术，人们可以全面跟踪整个在小鼠内源性T细胞表位的特定人群的免疫反应的所有阶段。

研究方案

1。淋巴组织细胞分离

1. 加入1毫升：冰：冷cEHAA（EHAA + 10％FBS，钢笔/链球菌，庆大霉素，2mM的L-谷氨酰胺，55 mM的2 - 巯基乙醇）或其它等效的T细胞的介质，以60毫米的培养皿中含有一个小正方形100μm的尼龙网和冰。
2. 安乐死鼠标。
3. 取出脾和淋巴结尽可能方便。这些措施应包括至少在腹股沟，腋窝，上臂，子宫颈癌，肠系膜淋巴结肿大。将它们放置在顶部的尼龙网眼的培养皿中。
4. 使用平顶一个封闭的1.5 ml离心管中， 轻轻捣烂的尼龙网，解放淋巴细胞的淋巴组织。的cEHAA和移液管向上和向下添加另一1毫升的工作到悬浮液中的细胞。通过另一块尼龙筛放在15ml的聚丙烯离心管中的顶部，将细胞转移。洗净的菜和另1毫升冰冷的cEHAA，宝网oling卷到同一管内。重复实现了最终的细胞悬浮液体积为4ml。
5. 加入冷的分拣机缓冲液（PBS + 2％FBS，0.05％叠氮化物），至终体积为15毫升，离心管在300×g离心5分钟，4℃下
6. 小心地吸出上清液，确保没有在管的侧面上留下的液体微滴。中：Fc的嵌段（分拣机缓冲液+ 2.4G2抗体）中重悬细胞沉淀，至终体积等于大约两倍的颗粒本身。例如，一个天真的小鼠的脾和淋巴结肿大，通常会产生一个约100微升细胞沉淀。在这种情况下，加入100μl的Fc块，使体积至200μl。如果已经发生了很大程度的细胞结块，小心地取出细胞聚集在这一点上与枪头。

2。四聚体染色

1. 添加PE-或APC-标记的住房抵押贷款公司四聚体，使最终浓度为10nM（或凭经验优化的浓度）。
2. Mix和温浴特1小时，在室温下（或凭经验优化时间和温度）。
3. 加入冷分拣机缓冲液至体积为15毫升，离心管，4℃，300×g离心5分钟将样品在冰上或4°C从现在开始。
4. 小心地吸出上清液，确保没有在管的侧面上留下的液体微滴。分拣机，至终体积为200μl的缓冲液中重悬细胞沉淀。对于双四聚体富集，重悬，至终体积为150μl。

3。磁富集

1. 美天旎抗-PE或抗-APC微球中加入50微升。对于双四聚体浓缩，加入50微升两个。
2. 混合孵育20分钟，在4°C。
3. 加入冷分拣机缓冲液至体积为15毫升，离心管，4℃，300×g离心5分钟
4. 在等待过程中，成立了美天旎LS在MidiMACS或QuadroMACS磁铁的磁性列。上一个开放的15毫升的聚丙烯离心管中放置机架的正下方列。
5. 3毫升分拣机缓冲液加入到柱顶部，允许它排放到15毫升的试管。
6. 放置为100μm的尼龙网正方形柱顶部。
7. 当细胞已完成纺纱，小心地吸出上清液，将沉淀重悬于3毫升分拣机缓冲液。
8. 细胞悬浮液转移到柱顶部通过尼龙筛。
9. 当细胞悬浮液已完全耗尽成列，与另外3毫升分拣机缓冲液冲洗的原管和传输缓冲器通过尼龙筛入列，漂洗的过程中啮合。丢弃的尼龙网。
10. 当缓冲区已完全耗尽入列，另外3毫升分拣机的缓冲列。
11. 共3×3毫升洗涤，重复步骤10。
12. 列磁铁和一个新的15毫升的聚丙烯离心管中取出。
13. 加入5毫升分拣机的缓冲吨他列。
14. 立即将柱塞压入列的顶部，在一个连续的动作，推动柱塞一路下来，强迫将缓冲区列管。
15. 含有洗脱的结合的部分和流过的未结合的部分在300×g离心5分钟，4℃下离心管
16. 小心地吸出上清液从绑定的馏分，确保没有在管的侧面上留下的液体微滴。细胞沉淀重悬在分拣机的缓冲液中，至终体积正好95微升。吸液和未结合的级分重新悬浮至终体积为2ml。

4。流式细胞仪

1. 对于每个馏分，取出5微升，并加至200μl的计数珠（调整到200,000 /毫升在分拣机的缓冲液中的浓度）在5毫升的FACS管。抛开在4°C后进行分析。为了节省时间，珠可以预先等分标记的试管中，在实验开始之前。
2. 准备是翠菊混合的抗体染色的细胞表面标志物（ 表1）。为了节省时间，这可以做到在实验开始前的。
3. 对于绑定的馏分，直接添加一个剂量的抗体鸡尾酒〜90微升的细胞在管内。如果未结合的部分的分析，需要的话，90微升的细胞转移到一个5毫升的FACS管中，并添加一个剂量的抗体鸡尾酒。
4. 设置为流式细胞仪单色补偿控制面板。以使用对于每个荧光染料，混合5毫升FACS管中的剩余的未结合的部分细胞加入50μl用1μl的共轭到相应的荧光染料的抗CD4抗体。记住设立染色的控制，以及。
5. 涡街流量计和培育所有样品为30分钟，在4°C
6. 在300×g离心5分钟，4℃，加入5毫升分拣机的缓冲液中，以每管和离心机
7. 绑定馏分，小心吸上清液和细胞悬浮在200μl分拣机buf中FER。转移到了1.2毫升的FACS微管细胞。冲洗管到相同的微管200微升分拣机的缓冲区和游泳池。如果细胞团块是显而易见的，通过细胞通过一个50微米的过滤器。
8. 对于未结合的部分补偿控制，倒出或吸出上清液，重悬在2毫升分拣机的缓冲区。
9. 设置的流式细胞仪使用单色的补偿控制。作为一个额外的参数被记录，选择侧向散射宽度（SSC-W）。
10. 分析连续列入门使用的序列，以确定CD4 +或CD8 + T细胞，如在图1和图2所示的染色样品。结合态，收集尽可能多的细胞尽可能最大的200事件总数。对于未绑定的部分，收集1,000,000总额事件。保持或低于3000事件每秒采集速率。
11. 使用同一台机器上设置，计数珠样品进行分析。收集10,000个事件。
12. FCS文件保存所有数据。

5。数据分析

1. FCS数据文件的计数珠样本，使用FlowJo软件分析。绘制前方散射由FITC和设置栅极aroung的计数珠（请参阅图1和图2）。确定计数每个样品中检测到的小珠的总数。从收集的事件总数中减去的数量来确定的细胞收集的事件。
2. 计算在每个样品中的所有细胞，使用框1中列出的方程的总数。
3. 分析FCS数据文件的彩色绑定和未绑定的部分样品。连续列入门设定一个序列，以确定淋巴+侧分散宽度^卤味 ，转储，CD3 +，CD4 +或CD8 +，四聚体+ T细胞在每个样品中，如在图1和图2中示出。
4. 总量乘以频率每个列入门用于定义CD4 +四聚体的样品中的细胞数，由+或CD8 +四聚体+细胞的表位特异性T细胞（专栏1）计算的总数量。

结果

图1描述了代表性的流式细胞仪地块pMHCII四聚体富集的脾脏和淋巴结从幼稚小鼠的样品，而图2示出了有代表性的数据，先前与相关肽+ CFA免疫小鼠。串行浇注删除的分析CD4 + T细胞群的自体荧光和其他有害事件。的CD8 + T细胞群体作为一个有用的内部pMHCII四聚体染色的CD4 + T细胞的阴性对照。需要注意的是结合态的富集通常包含一个显着较高比例的自体荧光的细胞比未结合的?...

讨论

本协议提出的住房抵押贷款公司四聚体为基础的细胞富集方法的研究表位特异性T细胞内源性T细胞剧目是一个功能强大的工具。住房抵押贷款公司四聚体的使用，可以直接基于绑定同源住房抵押贷款公司配体的能力，其电阻温度系数的表位特异性的T细胞的检测。的富集提供了一个极为罕见的群体可以检测到抗原特异性T细胞的T细胞内源性剧目没有他们的基因构成任何操作或前体频率的灵敏度水平?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE或APC标记的住房抵押贷款公司四聚体（多聚体）
美天旎	130-048-801
防APC共轭磁珠	美天旎	130-090-855
LS磁列	美天旎	130-042-401
MidiMACS或QuadroMACS磁铁	美天旎	130-042-302或130-090-976
细胞计数珠	生命科技	PCB-100