펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

요약

에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를 수 생체 내 실험 시스템.

초록

생체 실험 모델과 적응 면역을 공부 연구자에 대한 기본적인 필요는 T 세포 항원 수용체 (TCR) 특이성에 따라 T 세포를 식별 할 수 있다는 것입니다. 많은 간접 방법은 T 세포의 대량 인구가 특정 항원과 에피토프 특정 T 세포 등 확산, 시토 킨 생산, 또는 활성 마커 ^하나의 표현과 같은 기능 응답의 측정을 통해 확인할 수 있습니다와 체외에서 자극되는 이용하실 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 여러 가지 기능 중 하나를 전시 에피토프 특정 T 세포를 식별, 그들은 순진한 전구체 주파수에서 에피토프 특정 T 세포를 감지 할 수있을만큼 문자를 구분하지 않습니다. 인기있는 대안은, TCR 유전자 변형 입양 이전 모델 인에서 TCR 유전자 변형 마우스의 단클론 T 세포는 easi 수 있습니다 에피토프 특정 T 세포의 큰 전구체 인구를 만들 histocompatible 호스트에 놓는 아르통증은 congenic 마커 항체 ^2,3의 사용을 추적. 강력한 있지만,이 방법은 ^4,5 하나의 에피토프에 대한 특이성과 T 세포의 unphysiological 주파수와 관련된 실험 유물을 앓고. 또한,이 시스템은 polyclonal 인구에서 에피토프 특정 T 세포 클론의 기능 이질성을 조사하는 데 사용할 수 없습니다.

MHC (pMHC) 단지 : 적응 면역을 연구 할 수있는 이상적인 방법은 전적으로 해당 펩타이드 기원에 바인딩하여 TCR의 특이성을 구별하는 방법을 사용하여 내생 T 세포 레퍼토리의 에피토프 특정 T 세포의 직접 검출을 포함해야합니다. pMHC tetramers 및 유동 세포 계측법의 사용이 ⁶ 달성 있지만 다음과 같은 항원 유발 clonal 확장을 발견 에피토프 특정 T 세포의 높은 주파수 인구의 감지로 제한됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 pMHC의 tetramers의 사용을 조정 방법 및 magne을 설명틱 세포 농축 기술은 마우스 림프 조직 ^3,7에서 매우 낮은 주파수 에피토프 특정 T 세포의 탐색 기능을 사용하도록 설정합니다. 이 기술로, 하나는 종합적으로 면역 반응의 모든 단계에서 쥐 내생 T 세포의 전체 에피토프 별 인구를 추적 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 림프 조직에서 세포 절연

1. 의 작은 사각형이 포함 된 60mm 문화 요리에, 얼음 차가운 cEHAA (EHAA + 10% FBS, 펜 / 패 혈성, gentamycin, 2 MM L-글루타민, 55 MM 2 메르 캅토 에탄올) 또는 기타 이에 상응하는 T 세포 매체 1 ML을 추가 얼음에 100 μm 나일론 메쉬 및 장소.
2. 마우스를 안락사시켜야.
3. 비장 가능한 많은 쉽게 접근 할 수 림프절을 제거합니다. 이러한 적어도 사타구니, 겨드랑이, 상완, 자궁 경부, 그리고 장간막 림프절을 포함해야합니다. 배양 접시에있는 나일론 메쉬의 상단에 올려 놓으십시오.
4. 부드럽게 덧는 림프구를 해방하기 위해 나일론 메쉬 동안 폐쇄 1.5 ML의 microfuge 튜브의 평면 상단을 림프 조직 사용합니다. 정지에 셀을 작업 할 cEHAA와 pipet 위아래로 다른 한 ML을 추가합니다. 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브의 맨 위에 위치 나일론 메쉬의 또 다른 작품을 통해 셀을 전송합니다. 얼음 차가운 cEHAA, PO의 또 다른 한 ML 함께 그릇과 메쉬를 씻어같은 관에 볼륨을 oling. 4 ML의 최종 세포 현탁액 볼륨을 달성하기 위해 반복합니다.
5. 15 ML의 최종 볼륨 (PBS + 2% FBS, 0.05 % Azide) 차가운 정렬 버퍼를 추가, 4, 300 XG에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 ° C.
6. 조심스럽게 액체의 어떤 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 표면에 뜨는을 대기음. 약 두 번 펠렛 자체의와 동일한 최종 볼륨으로 FC 블록 (정렬 버퍼 + 2.4G2 항체)의 세포 펠렛을 Resuspend. 예를 들어, 순진한 마우스 비장과 림프 노드는 일반적으로 약 100 μl의 세포 펠렛을 생산하고 있습니다. 이 경우, 200 μl의 볼륨을 가져 FC 블록 100 μl를 추가합니다. 셀 거리며 걷게의 큰 학위가 발생했습니다 경우, 조심스럽게 pipet 팁을이 시점에서 세포 덩어리를 제거합니다.

2. Tetramer의 착색

1. 10 나노 미터 (또는 경험적으로 최적화 된 농도)의 최종 농도에 PE 또는 APC-라벨 pMHC tetramer를 추가합니다.
2. 믹스와 incuba실내 온도 (또는 경험적으로 최적화 시간 및 온도)에서 1 시간에 테.
3. 15 ML의 볼륨에 감기 정렬 버퍼를 추가하고 300 XG, 4 ° C.에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 얼음 또는 ° C 지금부터 4에 샘플을 보관.
4. 조심스럽게 액체의 어떤 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 표면에 뜨는을 대기음. 200 μl의 최종 볼륨으로 정렬 버퍼에있는 셀 펠렛을 Resuspend. 더블 tetramer 농축를 들어, 150 μl의 최종 볼륨 resuspend.

3. 자기 강화

1. Miltenyi 방지 PE 또는 안티 APC microbeads의 50 μl를 추가합니다. 더블 tetramer 농축를 들어, 50 μl를 추가합니다.
2. 4에 섞어서 20 분에 품다 ° C.
3. 15 ML의 볼륨에 감기 정렬 버퍼를 추가하고 300 XG, 4 ° C.에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기
4. 기다리는 동안 MidiMACS 또는 QuadroMACS 자석에 Miltenyi LS 자기 열을 설정합니다. 에 문이 열려있는 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브의 위치를열 아래에 직접 올릴 수.
5. 가 15 ML 튜브로 배수 할 수 있도록, 컬럼의 상단에 정렬 버퍼 3 ML을 추가합니다.
6. 칼럼의 상단에 100 μm 나일론 메쉬 광장을 배치합니다.
7. 세포가 회전이 완료되면, 조심스럽게 표면에 뜨는을 기음과 정렬 버퍼 3 ML에서 펠렛을 resuspend.
8. 열 상단 위에 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 전송합니다.
9. 세포 현탁액이 완전히 열을 배출되면, 정렬 버퍼의 다른 3 ML로 원래 튜브를 씻어 열로 나일론 메쉬를 통해 버퍼를 전송 과정에서 메쉬를 린스. 나일론 메쉬를 폐기하십시오.
10. 버퍼가 완전히 열을 배출되면 열을 정렬 버퍼의 또 다른 3 ML를 추가합니다.
11. 3 × 3 ML 세차 총 10 단계를 반복합니다.
12. 새로운 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브를 통해 자석과 장소에서 열을 제거합니다.
13. t로 정렬 버퍼의 5 ML을 추가그는 열.
14. 즉시 열 상단에 플런저를 삽입하고 하나의 연속 동작으로, 튜브에 열을 밖으로 버퍼를 강제, 플런저 모든 방법을 아래로 밀어.
15. 300 XG에서 5 분의 용출 바인딩 된 분수와 흐름을 통해 언 바운드 분수, 4 ° C.를 포함하는 튜브를 원심 분리기
16. 액체의 더 작은 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 바인딩 분수에서 표면에 뜨는을 자세히 대기음. 정확히 95 μl의 최종 볼륨으로 정렬 버퍼에있는 셀 펠렛을 Resuspend. 기음과 2 ML의 최종 볼륨에 언 바운드 일부를 resuspend.

4. 유동 세포 계측법

1. 각 분수를 들어, 5 μl를 제거하고 5 ML의 FACS 관 계수 구슬 200 μl (정렬 버퍼에 200,000 / ML의 농도로 조정)에 추가 할 수 있습니다. 4에 정해 ° C를 분석하기. 시간을 절약하기 위해 구슬은 실험 시작 전에 레이블 튜브에 미리 aliquoted 할 수 있습니다.
2. 오전 준비항체의 애 스터 믹스는 세포의 표면 마커 (표 1) 얼룩합니다. 시간을 절약하기 위해, 이것은 실험의 시작하기 전에 수행 할 수 있습니다.
3. 바인딩 된 분수를 들어, 관 세포 ~ 90 μl에 직접 항체 칵테일의 복용을 추가합니다. 언 바운드 분수의 분석이 필요하다면, 5 ML의 FACS 튜브에 세포의 90 μl를 전송하고 항체 칵테일의 복용을 추가합니다.
4. 흐름 cytometer위한 단일 색상 보정 컨트롤 패널을 설정합니다. 사용 할 각각의 fluorochrome를 들어, 해당 fluorochrome에 복합 항 CD4 항체 1 μl로 5 ML의 FACS 관에 남은 언 바운드 분획 세포의 50 μl를 섞는다. 뿐만 아니라 흠없는 제어를 설정해야합니다.
5. 소용돌이와 4에서 30 분의 모든 샘플을 품다 ° C.
6. 300 XG에서 5 분, 4 ° C. 각 튜브와 원심 분리기로 정렬 버퍼의 5 ML을 추가
7. 바인딩 된 분수를 들어, 신중하게 정렬 buf 200 μl의 세포 표면에 뜨는 기음 및 resuspend남았다. 1.2 ML의 FACS의 microtube에 세포를 전송합니다. 같은 microtube에 정렬 버퍼와 수영장의 또 다른 200 μl로 관을 씻어. 셀 clumps이 명백 경우, 50 μm 필터를 통해 세포를 전달합니다.
8. 언 바운드 분율 및 보상 제어, 가만히 따르다 또는의 표면에 뜨는 및 resuspend 두 ML의 정렬 버퍼를 대기음하십시오.
9. 단일 색 보정 컨트롤을 사용하여 흐름 cytometer를 설정합니다. 기록 할 추가 매개 변수로 측 분산 폭 (SSC-W)를 선택합니다.
10. 도 1 및도 2에 도시 된 바와 같이 + 나 CD8 + T 세포 CD4을 식별 할 연속 포함 된 문의 순서를 사용하여 스테인드 샘플을 분석합니다. 바인딩 분수를 들어, 최대 2,000,000 총 이벤트의 최대 가능한 한 많은 세포를 수집합니다. 언 바운드 분수를 들어, 1,000,000 총 이벤트를 수집합니다. 수집 속도 초당 이벤트이나 3000 아래하세요.
11. 같은 시스템 설정을 사용하여 계산 비드 샘플을 분석 할 수 있습니다. 10,000 총 이벤트를 수집합니다.
12. FCS 파일로 모든 데이터를 저장합니다.

5. 데이터 분석

1. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 계산 비드 샘플에 대한 FCS 데이터 파일을 분석합니다. 플롯 앞으로 FITC의 분산 및 (그림 1과 2 참조) 계산 구슬을 aroung 게이트를 설정합니다. 각 샘플에서 발견 비즈를 계산의 총 수를 결정합니다. 수집 셀 이벤트의 수를 결정하기 위해 수집 이벤트의 총 수에서 뺍니다.
2. 박스 1에서 설명한 방정식을 사용하여 각 샘플에있는 모든 세포의 총 수를 계산합니다.
3. 스테인드 바운드 및 언 바운드 일부 샘플에 대한 FCS 데이터 파일을 분석합니다. 림프 +, 측면 산란 - 너비 ^이오, 덤프 -, 3 번 CD +, CD4 + 또는 CD8 +, tetramer도 1 및도 2에 도시 된 바와 같이 각 예제에서 + T 세포.을 식별 할 연속 포함 된 문의 순서를 설정
4. CD4을 정의하는 데 사용 포함 된 문이 각각의 주파수 + tetramer하여 샘플에서 세포의 총 수를 모두 곱하면+ 또는 CD8 + tetramer + 세포 에피토프 특정 T 세포 (박스 1)의 총 수를 계산합니다.

결과

그림 2는 이전에 관련 펩타이드 + CFA와 함께 예방 접종을 쥐 대표 데이터를 묘사하면서 그림 1은 순진 쥐에서 pMHCII tetramer 강화 비장과 림프절 샘플을 대표하는 유동 세포 계측법의 음모를 도시한다. 시리얼 게이트는 CD4의 분석 + T 세포 인구에서 autofluorescent 및 기타 원치 않는 이벤트를 제거합니다. CD8 + T 세포 인구는 CD4의 pMHCII tetramer의 착색 + T 세포에 유용한 내부 대조군...

토론

이 프로토콜에서 제공 pMHC tetramer 기반의 세포 농축 방법은 내생 T 세포 repertoires에서 에피토프 특정 T 세포를 연구하기위한 강력한 도구입니다. pMHC의 tetramers의 사용은 직접적으로 기원 pMHC 리간드를 구속하기 위해 자신의 TCRs의 능력에 따라 에피토프 특정 T 세포의 확인을 할 수 있습니다. 강화는 항원에 특정한 T 세포의 매우 희귀 한 인구는 자신의 유전 메이크업이나 전구체 주파수의 조작없이 T ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE 또는 APC 복합 pMHC tetramer (또는 multimer)	NIH tetramer 코어에서 얻은, 조사원에 의해 제작, 또는 상업적 소스에서 구입
안티 - PE 복합 자성 microbeads	Miltenyi	130-048-801
안티 - APC 복합 자성 microbeads	Miltenyi	130-090-855
LS 자기 열	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS 또는 QuadroMACS 자석	Miltenyi	130-042-302 또는 130-090-976
셀 계산 비즈	생명 기술	PCB-100