Peptide: MHC Tetramero basata Arricchimento di epitopi specifici per cellule T

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'uso del peptide: MHC tetrameri e microsfere magnetiche per isolare popolazioni bassa frequenza di epitopo-specifiche cellule T e analizzarli mediante citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio diretto delle popolazioni di cellule T endogene di interesse da In vivo Sistemi sperimentali.

Abstract

Una necessità di base per i ricercatori che studiano immunità adattativa con modelli sperimentali in vivo è la capacità di identificare cellule T in base al loro recettore antigene sulla cellula T (TCR) specificità. Molti metodi indiretti sono disponibili in cui una popolazione di cellule T bulk è stimolata in vitro con un antigene specifico epitopo-specifici e le cellule T sono identificati mediante la misurazione di una risposta funzionale come proliferazione, produzione di citochine, o l'espressione di marcatori di attivazione ^1. Tuttavia, questi metodi solo identificare epitopi specifici per cellule T presentano una delle tante possibili funzioni, e non sono sufficientemente sensibili per rilevare le cellule T epitopo-specifici a frequenze precursori naive. Un'alternativa popolare è il modello transgenico trasferimento TCR adottiva, in cui le cellule T monoclonali da un topo transgenico TCR sono seminati in istocompatibili host per creare una vasta popolazione precursore di epitopo-specifiche cellule T che possono essere facilly cingolato con l'uso di un anticorpo marcatore congenic ^2,3. Mentre potente, questo metodo soffre di artefatti sperimentali associate alla frequenza fisiologica di cellule T con specificità per un singolo epitopo ^4,5. Inoltre, questo sistema non può essere usato per studiare l'eterogeneità funzionale di epitopo-specifici cloni di cellule T all'interno di una popolazione policlonale.

Il modo ideale per studiare l'immunità adattativa dovrebbe coinvolgere il rilevamento diretto di cellule T epitopo-specifici del repertorio endogeno delle cellule T utilizzando un metodo che distingue la specificità TCR esclusivamente dal suo legame con l'affine peptide: MHC (pMHC) complessi. L'utilizzo di tetrameri pMHC e citometria di flusso realizza questo ^6, ma è limitata alla rilevazione di popolazioni ad alta frequenza di epitopo-specifiche cellule T solo trovati seguente indotta da antigene espansione clonale. In questo protocollo, si descrive un metodo che coordina l'uso di tetrameri pMHC e magnetecnologia delle celle tic arricchimento abilitare il rilevamento di frequenza estremamente bassa epitopo-specifiche cellule T di topo tessuti linfoidi ^3,7. Con questa tecnica, si può globalmente intera traccia epitopo-specifiche popolazioni di cellule T endogene in topi in tutte le fasi della risposta immunitaria.

Protocollo

1. Isolamento delle cellule da tessuto linfoide

1. Aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen / strep, gentamicina, 2 mM L-glutammina, 55 mM 2-mercaptoetanolo) o altro equivalente mezzo di cellule T, un piatto di coltura di 60 millimetri contenente un piccolo quadrato di nylon 100 micron maglia e posto sul ghiaccio.
2. Eutanasia mouse.
3. Rimuovere la milza e come molti nodi linfatici facilmente accessibili possibile. Queste dovrebbero includere almeno le inguinali, ascellari, brachiale, linfonodi cervicali, e mesenterici. Metterli sulla parte superiore della maglia di nylon in piatto di coltura.
4. Utilizzando la cima piatta di una provetta da microcentrifuga 1,5 chiuso ml, schiacciare delicatamente il tessuto linfoide sulla maglia di nylon per liberare linfociti. Aggiungere un altro 1 ml di cEHAA e pipettare su e giù per lavorare le cellule in una sospensione. Trasferire le cellule attraverso un altro pezzo di maglia di nylon posizionato sopra di un tubo da centrifuga 15 ml polipropilene. Sciacquare il piatto e la rete con un altro 1 ml di ghiaccio freddo cEHAA, pooling i volumi nel tubo stesso. Ripetere per ottenere un volume finale di sospensione di cellule di 4 ml.
5. Aggiungere tampone freddo sorter (PBS + 2% FBS, azide 0,05%) ad un volume finale di 15 ml e centrifugare la provetta per 5 minuti a 300 xg, a 4 ° C.
6. Aspirare accuratamente il supernatante, assicurandosi senza goccioline di liquido vengono lasciati sui lati del tubo. Risospendere il pellet cellulare in Fc block (sorter tampone + 2.4G2 anticorpo) ad un volume finale pari a circa due volte quella della stessa pellet. Ad esempio, i milza e linfonodi di un mouse ingenua solitamente produce un pellet di cellule di circa 100 pl. In questo caso, aggiungere 100 microlitri di blocco Fc per portare il volume a 200 pl. Se un elevato grado di aggregazione delle cellule si è verificato, rimuovere con attenzione il gruppo della cella a questo punto con una punta della pipetta.

2. Tetramero colorazione

1. Aggiungere o PE-APC-etichettati pMHC tetramero ad una concentrazione finale di 10 nM (o concentrazione empiricamente ottimizzata).
2. Mix e incubazionete per 1 ora a temperatura ambiente (o tempo empiricamente ottimizzata e temperatura).
3. Aggiungere tampone freddo sorter ad un volume di 15 ml e centrifugare la provetta per 5 minuti a 300 xg, a 4 ° C. I campioni in ghiaccio oa 4 ° C da ora.
4. Aspirare accuratamente il supernatante, assicurandosi senza goccioline di liquido vengono lasciati sui lati del tubo. Risospendere il pellet di cellule in tampone sorter ad un volume finale di 200 microlitri. Per l'arricchimento tetramero doppia, risospendere ad un volume finale di 150 microlitri.

3. Arricchimento magnetica

1. Aggiungere 50 ml di microsfere Miltenyi anti-PE o anti-APC. Per arricchimento tetramero matrimoniale, aggiungere 50 microlitri di entrambi.
2. Mescolare e incubare per 20 min a 4 ° C.
3. Aggiungere tampone freddo sorter ad un volume di 15 ml e centrifugare la provetta per 5 minuti a 300 xg, a 4 ° C.
4. In attesa, impostare una colonna Miltenyi LS magnetico su un magnete MidiMACS o QuadroMACS. Posizionare un tubo di polipropilene aperta 15 ml centrifuga su unaaccumulare direttamente sotto la colonna.
5. Aggiungere 3 ml di tampone sorter alla sommità della colonna, permettendo di scarico nel tubo 15 ml.
6. Inserire un quadrato di nylon 100 micron maglie sulla sommità della colonna.
7. Quando le cellule hanno finito la filatura, aspirare accuratamente il supernatante e risospendere il pellet in 3 ml di tampone sorter.
8. Trasferire la sospensione cellulare attraverso la rete di nylon sulla parte superiore della colonna.
9. Quando la sospensione cellulare viene scaricata completamente nella colonna, lavare il tubo originale con altro 3 ml di tampone sorter e trasferire il buffer attraverso la rete di nylon nella colonna, risciacquo la maglia del processo. Gettare la rete di nylon.
10. Quando il buffer è svuotato completamente nella colonna, aggiungere un altro 3 ml di tampone sorter alla colonna.
11. Ripetere il passaggio 10 per un totale di 3 x 3 ml lavaggi.
12. Rimuovere la colonna dal magnete e sistemarla su un nuovo tubo da centrifuga 15 ml in polipropilene.
13. Aggiungere 5 ml di tampone sorter di tegli colonna.
14. Inserire immediatamente lo stantuffo nella parte superiore della colonna e un movimento continuo, spingere lo stantuffo fino in fondo, costringendo il buffer la colonna nel tubo.
15. Centrifugare le provette contenenti la frazione eluita associato e l'deflusso frazione non legata per 5 min a 300 xg, a 4 ° C.
16. Aspirare accuratamente il supernatante dalla frazione legata, assicurandosi senza goccioline di liquido vengono lasciati sui lati del tubo. Risospendere il pellet di cellule in tampone sorter ad un volume finale di 95 microlitri esattamente. Aspirare e risospendere la frazione non legata ad un volume finale di 2 ml.

4. Citometria a Flusso

1. Per ciascuna frazione, rimuovere 5 microlitri ed aggiungere 200 ml di perline di conteggio (regolato ad una concentrazione di 200.000 / ml in tampone sorter) in una provetta 5 ml FACS. Mettere da parte a 4 ° C per una successiva analisi. Per risparmiare tempo, perline possono essere pre-aliquotati per provette etichettate prima dell'inizio dell'esperimento.
2. Preparare amaster mix di anticorpi per colorare marcatori di superficie sulle cellule (Tabella 1). Per risparmiare tempo, questo può essere fatto prima dell'inizio dell'esperimento.
3. Per la frazione legata, aggiungere una dose di cocktail di anticorpi direttamente al 90 ~ microlitri di cellule nel tubo. Se l'analisi della frazione non legata è desiderato, trasferire 90 microlitri di cellule in una provetta da 5 ml FACS e aggiungere una dose di cocktail di anticorpi.
4. Impostare un gruppo di monocolore controlli di compensazione per il citofluorimetro. Per ciascun fluorocromo da utilizzare, miscelare 50 microlitri di cellule non legate frazione rimanenti in un tubo 5 ml FACS con 1 pl di anticorpo anti-CD4 coniugato al fluorocromo corrispondente. Ricordate di impostare un controllo senza macchia pure.
5. Vortex e incubare tutti i campioni per 30 min a 4 ° C.
6. Aggiungere 5 ml di tampone sorter a ciascuna provetta e centrifugare per 5 min a 300 xg, a 4 ° C.
7. Per la frazione legata, aspirare accuratamente il surnatante e risospendere le cellule in 200 ml di buf sorterfer. Trasferire le cellule in una provetta 1,2 ml FACS. Sciacquare il tubo con un altro 200 microlitri di tampone sorter e la piscina nella stessa provetta. Se ciuffi cellulari sono evidenti, passare le cellule attraverso un filtro 50 micron.
8. Per la frazione libera e controlli di compensazione, decantare o aspirare il surnatante e risospendere in 2 ml di tampone sorter.
9. Impostare il citofluorimetro utilizzando il solo colore controlli di compensazione. Selezionare side scatter-larghezza (SSC-W) come parametro aggiuntivo da registrare.
10. Analizzare i campioni colorarle con una sequenza di porte inclusione successive per identificare CD4 + o CD8 + cellule T, come illustrato nelle figure 1 e 2. Per le frazioni legate, raccogliere le cellule il più possibile fino ad un massimo di 2.000.000 di eventi totali. Per le frazioni non legate, raccogliere 1.000.000 eventi totali. Mantenere la velocità di acquisizione pari o inferiore a 3.000 eventi al secondo.
11. Utilizzando le impostazioni della macchina stessa, analizzare i campioni di conteggio tallone. Raccogliere 10.000 eventi totali.
12. Salvare tutti i dati come file FCS.

5. Analisi dei dati

1. Analizzare FCS file di dati per i campioni di conteggio tallone utilizzando il software FlowJo. Diagramma a dispersione in avanti da FITC e impostare una porta era infatti proprio dietro le perle di conteggio (vedi figure 1 e 2). Determinare il numero totale di conteggio perline rilevate in ciascun campione. Sottrarre dal numero totale di eventi raccolti per determinare il numero di eventi cellulari raccolti.
2. Calcolare il numero totale di tutte le celle in ogni campione utilizzando le equazioni descritte nel riquadro 1.
3. Analizzare FCS file di dati per i campioni colorati frazione legati e non legati. Impostare una sequenza di porte inclusione successive per identificare + linfoide, side-scatter-larghezza ^lo, dump-, CD3 +, CD4 + o CD8 +, tetramero + cellule T in ogni campione come illustrato nelle figure 1 e 2.
4. Moltiplicare il numero totale di cellule nel campione dalle frequenze di ciascuna delle porte di inclusione utilizzati per definire CD4 + tetramero+ O CD8 + cellule tetramero + per calcolare il numero totale di epitopo-specifiche cellule T (Box 1).

Risultati

La figura 1 illustra rappresentante trame citometria a flusso di milza pMHCII tetramero arricchito e campioni di linfonodi di topi naive, mentre la figura 2 mostra i dati rappresentativi per topi precedentemente immunizzati con il peptide corrispondente + CFA. Gating seriale rimuove eventi indesiderati autofluorescenti e altre dall'analisi di CD4 + popolazioni di cellule T. Il CD8 + popolazione di cellule T serve come controllo interno negativo utile per la colorazione pMHCII tetram...

Discussione

Il pMHC tetramero metodo basato arricchimento delle cellule presentata da questo protocollo è un potente strumento per lo studio delle cellule T epitopo-specifici di cellule T endogene repertori. L'utilizzo di tetrameri pMHC consente il rilevamento di epitopo-specifiche cellule T basati direttamente sulla capacità dei loro TCR per legare ligandi affini pMHC. L'arricchimento fornisce un livello di sensibilità in modo tale che le popolazioni estremamente rari di antigene-specifiche cellule T può essere rilevat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE o APC coniugato pMHC tetramero (o multimero)	Realizzato da investigatore, ottenuto dal nucleo NIH tetramero, o acquistati da fonti commerciali
Anti-PE microsfere coniugate magnetici	Miltenyi	130-048-801
Anti-APC microsfere coniugate magnetici	Miltenyi	130-090-855
Colonne LS magnetici	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS o QuadroMACS magnete	Miltenyi	130-042-302 o 130-090-976
Cell conteggio perline	Life Technologies	PCB-100