Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

Resumo

Este protocolo descreve o uso de péptido: MHC tetrâmeros e microesferas magnéticas para isolar populações de baixa frequência de células T específicas para epitopo e analisá-las por citometria de fluxo. Este método permite o estudo direto de endógenos populações de células T de interesse de In vivo Sistemas experimentais.

Resumo

Uma necessidade básica para os investigadores que estudam a imunidade adaptativa com modelos experimentais in vivo é a capacidade de identificar as células T com base no seu receptor de células T de antigénio (TCR) especificidade. Muitos métodos indirectos estão disponíveis em que uma população a granel de células T é estimulada in vitro com um antigénio específico e células T específicas do epítopo são identificadas através da medição de uma resposta funcional, como a proliferação, a produção de citocinas, ou a expressão de marcadores de activação ^1. No entanto, estes métodos apenas identificar as células T específicas para epitopo que exibem uma de muitas possíveis funções, e eles não são suficientemente sensíveis para detectar epítopos específicos de células T naive em frequências precursoras. Uma alternativa popular é o TCR transgénico modelo de transferência adoptiva, em que as células T monoclonais a partir de um ratinho transgénico TCR são semeadas em hospedeiros histocompatibilidade para criar um precursor população grande de células T específicas para epitopos que podem ser easily rastreados com o uso de um anticorpo marcador Congênicos ^2,3. Embora poderoso, este método sofre de artefactos experimentais associados não fisiológicas da frequência de células T com especificidade para um único epítopo ^4,5. Além disso, este sistema não pode ser utilizado para investigar a heterogeneidade funcional do epítopo específicos clones de células T dentro de uma população policlonal.

A forma ideal para o estudo da imunidade adaptativa deve envolver a detecção directa do epítopo de células T específicas a partir do repertório de células T endógeno, utilizando um método que diferencie a especificidade TCR unicamente pela sua ligação ao péptido cognato: (pMHC) do MHC complexos. O uso de tetrâmeros pMHC e citometria de fluxo realiza esta ^6, mas está limitado à detecção de populações de alta frequência de células T específicas para epitopo apenas encontrados a expansão induzida pelo antigénio seguinte clonal. Neste protocolo, descrevemos um método que coordena o uso de tetrâmeros pMHC e magnetic tecnologia de enriquecimento de células para permitir a detecção de frequências extremamente baixas células epítopo T específicas de tecidos de camundongos linfóides ^3,7. Com esta técnica, pode-se rastrear exaustivamente inteiras epitopo-populações específicas de células T endógenas em ratinhos em todas as fases da resposta imune.

Protocolo

1. Isolamento de células a partir de tecido linfóide

1. Adicionar 1 ml de gelo frio cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen / strep, gentamicina, 2 mM de L-glutamina, 55 mM 2-mercaptoetanol), ou outro meio equivalente de células T, para uma placa de cultura de 60 milímetros, contendo um pequeno quadrado de 100 malha de nylon fim e colocar no gelo.
2. Euthanize mouse.
3. Remover o baço e os linfonodos como muitos facilmente acessível quanto possível. Estes devem incluir pelo menos os inguinais, axilares, braquiais, linfonodos cervicais, e mesentérica. Colocá-las em cima da rede de nylon na placa de cultura.
4. Utilizando o plano superior de um sistema fechado de tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, suavemente esmagar o tecido linfóide sobre a malha de nylon para libertar os linfócitos. Adicionar 1 ml de uma outra cEHAA e pipeta cima e para baixo para o trabalho de células numa suspensão. Transferir as células através de um outro pedaço de malha de nylon colocada sobre a parte superior de um tubo de centrífuga de 15 ml de polipropileno. Lave o prato e malha com outro 1 ml de gelo frio cEHAA, pooling os volumes no mesmo tubo. Repetir para atingir um volume de suspensão final de células de 4 ml.
5. Adicionar tampão classificador frio (PBS + Azida de 2% de FBS, 0,05%) a um volume final de 15 ml e centrifugar o tubo durante 5 minutos a 300 xg, 4 ° C.
6. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, certificando-se gotículas de líquido não são deixados sobre os lados do tubo. Ressuspender o sedimento de células em Fc bloco (classificador de tampão + 2.4G2 anticorpo) a um volume final igual a cerca de duas vezes maior que o pellet em si. Por exemplo, os gânglios linfáticos e do baço de um ratinho ingénuo geralmente produz um pelete de células de cerca de 100 uL. Nesse caso, adicionar 100 ul de bloco de Fc para levar o volume para 200 ul. Se um grande grau de aglomeração de células ocorreu, remova cuidadosamente o aglomerado de células neste momento com uma pipeta.

2. Coloração tetrâmero

1. Adicionar PE-ou APC-rotulado pMHC tetrâmero para uma concentração final de 10 nM (concentração ou empiricamente optimizados).
2. Mix e incubaçãote durante 1 hora à temperatura ambiente (ou a hora empiricamente optimizados e temperatura).
3. Adicionar tampão classificador fria até um volume de 15 ml e centrifugar o tubo durante 5 minutos a 300 xg, 4 ° C. Manter as amostras em gelo ou a 4 ° C a partir de agora.
4. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, certificando-se gotículas de líquido não são deixados sobre os lados do tubo. Ressuspender o sedimento de células em tampão de classificador para um volume final de 200 ul. Para o enriquecimento de tetrâmero de casal, ressuspender a um volume final de 150 ul.

3. Enriquecimento magnética

1. Adicionar 50 ul de microesferas de Miltenyi anti-PE ou anti-APC. Para o enriquecimento de tetrâmero de casal, adicionar 50 ul de ambas.
2. Misturar e incubar durante 20 min a 4 ° C.
3. Adicionar tampão classificador fria até um volume de 15 ml e centrifugar o tubo durante 5 minutos a 300 xg, 4 ° C.
4. Enquanto espera, configurar uma Miltenyi coluna LS magnético em um ímã MidiMACS ou QuadroMACS. Uma posição aberta 15 ml tubo de centrífuga de polipropileno com umacumular diretamente abaixo da coluna.
5. Adicionar 3 ml de tampão de classificador para a parte superior da coluna, o que permite que seja drenado para o tubo de 15 ml.
6. Coloque um quadrado de 100 um de malha de nylon no topo da coluna.
7. Quando as células de ter terminado a fiação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 ml de tampão de classificador.
8. Transferir a suspensão de células através da malha de nylon para o topo da coluna.
9. Quando a suspensão de células foi completamente drenada para a coluna, lavar o tubo inicial com um outro de 3 ml de tampão e transferir o classificador de tampão através da malha de nylon para a coluna, lavagem da malha durante o processo. Descarte a malha de nylon.
10. Quando o tampão foi completamente drenada para a coluna, adicionar 3 ml de um outro tampão classificador para a coluna.
11. Repetir o passo 10 para um total de 3 x 3 ml lavagens.
12. Remover a coluna do magnete e local ao longo de um novo tubo de 15 ml de centrífuga de polipropileno.
13. Adicionam-se 5 ml de tampão de classificador de tele coluna.
14. Imediatamente inserir o êmbolo no topo da coluna e com um movimento contínuo, empurre o êmbolo para baixo, forçando o tampão para fora da coluna dentro do tubo.
15. Centrifugar os tubos contendo a fracção eluída ligado e a fracção não ligada por escoamento durante 5 minutos a 300 xg, 4 ° C.
16. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante a partir da fracção ligada, certificando-se gotículas de líquido não são deixados sobre os lados do tubo. Ressuspender o sedimento de células em tampão de classificador para um volume final de 95 ul exactamente. Aspirar e ressuspender a fracção não ligada a um volume final de 2 ml.

4. Citometria de Fluxo

1. Para cada fracção, remover e adicionar 5 ul a 200 ul de pérolas de contagem (ajustada para uma concentração de 200,000 / ml em tampão sorter) em um tubo de 5 ml de FACS. Separe a 4 ° C para análise posterior. Para poupar tempo, os grânulos podem ser pré-aliquotadas para tubos marcados antes do início da experiência.
2. Prepare amaster mistura de anticorpos para marcadores de superfície de manchar as células (Tabela 1). Para poupar tempo, isto pode ser feito antes do início da experiência.
3. Para a fracção ligada, adicionar uma dose de cocktail de anticorpos directamente para o ~ 90 ul de células no tubo. Se a análise da fracção não ligada é desejada, transferir 90 ul de células para um tubo de 5 ml de FACS e adicionar uma dose de cocktail de anticorpos.
4. Criação de um painel de controles de cor única compensação para o citômetro de fluxo. Para cada fluorocromo a ser utilizado, misturar 50 ul de células não ligadas que tenham ficado fracção num tubo de 5 ml de FACS com 1 ul de anticorpo anti-CD4 conjugado com o fluorocromo correspondente. Lembre-se de configurar um controle sem manchas também.
5. Agitar em vórtice e incubar as amostras durante 30 min a 4 ° C.
6. Adicionam-se 5 ml de tampão de classificador a cada tubo e centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, 4 ° C.
7. Para a fracção ligada, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as células em 200 ul de buf classificadorfer. Transferir as células para um microtubo de 1,2 ml de FACS. Enxaguar o tubo com outro ul de tampão 200 e separador de piscina para o microtubo mesmo. Se aglomerados de células são evidentes, passar as células através de um filtro ^ M 50.
8. Para a fracção livre e controles de compensação, decantar ou aspirar o sobrenadante e ressuspender em tampão classificador 2 ml.
9. Configure o citômetro de fluxo, utilizando os controles de cor única compensação. Selecione lado dispersão de largura (SSC-W) como parâmetro adicional a ser gravado.
10. Analisar as amostras coradas utilizando uma sequência de sucessivas portas de inclusão para identificar células CD4 + ou CD8 +, como ilustrado nas Figuras 1 e 2. Para frações encadernados, coletar células como muitos como possível até um máximo de 2.000.000 total de eventos. Para fracções não ligadas, recolher 1.000.000 total de eventos. Manter a velocidade de aquisição em ou abaixo de 3000 eventos por segundo.
11. Usando as configurações da máquina mesmo, analisar as amostras de contagem de contas. Colete 10.000 total de eventos.
12. Guarde todos os dados como arquivos FCS.

5. Análise de Dados

1. Analisar os arquivos de dados de FCS para as amostras de contagem de contas usando o software FlowJo. Dispersão trama para frente por FITC e definir uma porta aroung os colares de contas (ver Figuras 1 e 2). Determinar o número total de pérolas de contagem detectadas em cada amostra. Subtrair a partir do número total de eventos recolhidos para determinar o número de eventos celulares recolhidos.
2. Calcula-se o número total de todas as células em cada amostra, utilizando as equações descritas no Quadro 1.
3. Analisar os arquivos de dados para os FCS manchadas amostras fração associados e não associados. Defina-se uma sequência de sucessivas portas de inclusão para identificar + linfóide, do lado de dispersão de largura de ^eis-despejo, CD3 +, CD4 + ou CD8 +, células tetrâmero + T em cada uma das amostras tal como é ilustrado nas Figuras 1 e 2.
4. Multiplicar o número total de células na amostra por as frequências de cada um dos portões de inclusão usados ​​para definir CD4 + tetrâmero+ Ou CD8 + + tetrâmero células para calcular o número total de células T específicas do epítopo (Quadro 1).

Resultados

A Figura 1 mostra gráficos representativos de fluxo de citometria de pMHCII baço enriquecida tetrâmero e amostras de nódulos linfáticos de ratinhos ingénuos, enquanto que a Figura 2 mostra os dados representativos dos ratos anteriormente imunizados com o péptido relevante + CFA. Gating Serial remove autofluorescente e outros eventos indesejados a partir da análise das células T CD4 + populações de células T. A CD8 + da população de células T serve como um controlo interno...

Discussão

O pMHC tetrâmero método de enriquecimento baseado célula apresentada por este protocolo é uma ferramenta poderosa para estudar epítopo-específicas células T de endógenos repertórios de células T. O uso de tetrâmeros pMHC permite a detecção de células T específicas para epitopo diretamente dependente da capacidade dos seus TCR se ligar ligandos cognatos pMHC. O enriquecimento fornece um nível de sensibilidade de modo que as populações extremamente raros de células T específicas de antigénio pode ser ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE ou APC conjugada pMHC tetrâmero (ou multimeros)	Made pelo investigador, obtido a partir do núcleo do tetrâmero NIH, ou adquiridos de fontes comerciais
Anti-PE conjugados microesferas magnéticas	Miltenyi	130-048-801
Anti-APC conjugados microesferas magnéticas	Miltenyi	130-090-855
Colunas LS magnéticos	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS ou QuadroMACS ímã	Miltenyi	130-042-302 ou 130-090-976
Contagem de células contas	Life Technologies	PCB-100