Пептиды: MHC тетрамеров на основе обогащения эпитопов Т-клеток

Резюме

Этот протокол описывает использование пептидов: MHC тетрамеров и магнитных микросфер, чтобы изолировать низкой популяции частота эпитопов Т-клеток и их анализ с помощью проточной цитометрии. Этот метод позволяет непосредственное изучение эндогенных T клеточных популяций интерес со стороны В естественных условиях Экспериментальных систем.

Аннотация

Первой необходимости для исследователей, изучающих адаптивного иммунитета в естественных условиях экспериментальной модели является способность идентифицировать Т-клеток в зависимости от их рецепторов Т-клеточного антигена (TCR) специфичность. Многие косвенные методы доступны, в которых большая часть популяции Т-клеток стимулируется в пробирке со специфическим антигеном и эпитоп-специфических Т-клеток, определяются с помощью измерения функционального ответа, таких как пролиферация, продукции цитокинов, или экспрессия маркеров активации ^1. Однако, эти методы только определить эпитоп-специфических Т-клеток с одним из многих возможных функций, и они не достаточно чувствительны, чтобы обнаружить эпитоп-специфических Т-клеток на наивных частоты предшественника. Популярной альтернативой является TCR трансгенных приемных модель передачи, в которых моноклональных Т-клеток от мышей TCR трансгенных высевают в гистосовместимого хостов для создания большого населения предшественник эпитоп-специфических Т-клеток, которые могут быть EASIют отслеживается с использованием антител конгенных маркер ^2,3. В то время как мощные, этот метод страдает от экспериментальных артефактов, связанных с нефизиологические частота Т-клеток со спецификой для одного эпитопа ^4,5. Кроме того, эта система не может быть использован для исследования функциональной гетерогенности эпитоп-специфических Т-клеточных клонов в поликлональных населения.

Идеальный способ для изучения адаптивного иммунитета должны предусматривать прямое обнаружение эпитоп-специфических Т-клеток от эндогенных репертуара Т-клеток, используя метод, который отличает специфичность TCR исключительно его связывание с родственными пептид: MHC (ПКИКЖ) комплексов. Использование ПКИКЖ тетрамеров и проточной цитометрии решает эту задачу ^6, но ограничен обнаружения высокой частотой населения эпитоп-специфических Т-клеток можно найти только следующие антиген-индуцированной клональной экспансии. В этом протоколе, мы опишем метод, который координирует использование тетрамеров ПКИКЖ и Магнетик клетке технологии обогащения позволяют обнаружить крайне низкой частоты эпитоп-специфических Т-клеток от мышей лимфоидной ткани ^3,7. С помощью этого метода, можно всесторонне отслеживать весь эпитопа конкретных популяций эндогенных Т-клеток у мышей на всех этапах иммунного ответа.

протокол

1. Сотовые Изоляция от лимфоидной ткани

1. Добавить 1 мл ледяной cEHAA (EHAA + 10% FBS, ручки / стрептококк, гентамицин, 2 мМ L-глутамина, 55 мМ 2-меркаптоэтанола) или другим эквивалентным средних Т-клеток, на 60 мм культуры блюдо с небольшой площадью 100 мкм, нейлоновая сетка и место на льду.
2. Усыпить мыши.
3. Удалить селезенки и, как многие легко доступны лимфатических узлов, как это возможно. Они должны включать по крайней мере, паховые, подмышечные, плечевой, шейки матки и брыжеечных лимфатических узлов. Поместите их в верхней части нейлоновая сетка в культуре блюдо.
4. С помощью плоской вершине замкнутой 1,5 мл трубки микроцентрифужную, мягко разотрите лимфоидной ткани на нейлоновой сетки, чтобы освободить лимфоцитов. Добавить еще 1 мл cEHAA и пипетки вверх и вниз для работы клеток в суспензии. Передача клетки через другой кусок нейлоновой сетки помещается поверх 15 мл центрифужные пробирки из полипропилена. Промойте блюдо и сетка с другой 1 мл ледяной cEHAA, роОлинг объемы в ту же трубу. Повторите для достижения конечного объема клеточной суспензии 4 мл.
5. Добавить холодного буфера сортировщик (PBS + 2% FBS, 0,05% азида) до конечного объема 15 мл и центрифугируют трубку в течение 5 мин при 300 мкг, 4 ° C.
6. Осторожно аспирации супернатант, убедившись, что нет капель жидкости осталось по бокам трубки. Ресуспендируют осадок клеток в Fc блока (сортировщик буфера + 2.4G2 антитела) до конечного объема равна примерно в два раза, что гранулы себя. Например, селезенки и лимфатических узлов наивные мыши обычно приводит к клеточному осадку около 100 мкл. В этом случае, добавьте 100 мкл блок Fc, чтобы довести объем до 200 мкл. Если большой степени ячейки слипания произошло, аккуратно удалите ячейку комок в этой точке с пипеткой чаевых.

2. Тетрамеров Окрашивание

1. Добавить PE-или APC-меченных ПКИКЖ тетрамер до конечной концентрации 10 нМ (или эмпирически оптимизированы концентрации).
2. Смешать и инкубаторыТе в течение 1 часа при комнатной температуре (или эмпирически оптимизированы времени и температуры).
3. Добавить холодного буфера сортировщика до объема 15 мл и центрифугируют трубку в течение 5 мин при 300 мкг, 4 ° C. Храните образцы на льду или при температуре 4 ° C с этого момента.
4. Осторожно аспирации супернатант, убедившись, что нет капель жидкости осталось по бокам трубки. Ресуспендируют осадок клеток в буфере сортировки до конечного объема 200 мкл. Для двойного обогащения тетрамер, ресуспендируют до конечного объема 150 мкл.

3. Магнитного обогащения

1. Добавить 50 мкл Miltenyi анти-PE или анти-APC микрошарики. Для двойного обогащения тетрамер, добавить 50 мкл обоих.
2. Перемешать и инкубировать в течение 20 мин при 4 ° C.
3. Добавить холодного буфера сортировщика до объема 15 мл и центрифугируют трубку в течение 5 мин при 300 мкг, 4 ° C.
4. Во время ожидания, создать Miltenyi LS магнитной колонке на магнит MidiMACS или QuadroMACS. Установить открытые 15 мл полипропиленовые центрифужные пробирки наломать непосредственно под колонки.
5. Добавьте 3 мл сортировщик буфера в верхней части колонны, что позволяет ей стекать в 15 мл трубки.
6. Поместите 100 мкм нейлоновой сетки квадрат на верхнюю часть колонны.
7. Когда клетки закончили спиннинг, тщательно аспирации супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл буфера сортировки.
8. Передача клеточной суспензии через нейлоновую сетку на верхней части колонны.
9. Когда клеточная суспензия полностью сливают в колонку, промыть оригинальной трубки с другом 3 мл буфера сортировки и передачи буфера через нейлоновую сетку в колонну, промывка сетки в процессе. Откажитесь от нейлоновой сетки.
10. Когда буфер полностью сливают в колонку, добавить еще 3 мл буфера для сортировки столбцов.
11. Повторите шаг 10 на общую сумму 3 х 3 стирок мл.
12. Удалить столбец из магнитов и место над новым 15 мл центрифужные пробирки из полипропилена.
13. Добавить 5 мл буфера для сортировки тОн колонки.
14. Немедленно вставить поршень в верхней части колонны и в одном непрерывном движении, нажмите на поршень до упора, заставляя буфера из колонки в трубку.
15. Центрифуга пробирки, содержащие Элюированную связанной фракции и проточные несвязанной фракции в течение 5 мин при 300 мкг, 4 ° C.
16. Осторожно аспирации супернатант из фракции связанных, убедившись, что нет капель жидкости осталось по бокам трубки. Ресуспендируют осадок клеток в буфере сортировки до конечного объема 95 мкл точно. Аспирируйте и ресуспендируют несвязанной фракции в конечном объеме 2 мл.

4. Проточной цитометрии

1. Для каждой фракции, удалите 5 мкл и добавляют к 200 мкл считая бусины (с учетом концентрации 200000 / мл в буфере сортировки) в 5 мл трубки FACS. Отложите при 4 ° С для анализа позже. Чтобы сэкономить время, гранулы могут быть заранее помечены аликвоты для труб до начала эксперимента.
2. Подготовка утраастра смесь антител для окрашивания поверхностных маркеров на клетках (табл. 1). Чтобы сэкономить время, это может быть сделано до начала эксперимента.
3. Для связанной фракции, добавить дозу антител коктейль непосредственно на ~ 90 мкл клеток в пробирке. Если анализ несвязанные фракции желании передать 90 мкл клеток в 5 мл трубки FACS и добавить дозу антител коктейль.
4. Настройка панели одноцветные управления компенсацию за проточной цитометрии. Для каждого флуорохромом, которые будут использоваться, смешайте 50 мкл клеток оставшиеся свободные фракции в 5 мл трубки FACS с 1 мкл анти-CD4 антитела, конъюгированные с соответствующим флуорохромом. Не забудьте настроить неокрашенных контроль.
5. Vortex и инкубировать всех образцов в течение 30 мин при 4 ° C.
6. Добавить 5 мл сортировщик буфера в каждую пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 300 мкг, 4 ° C.
7. Для связанной фракции, тщательно супернатант и ресуспендирования клеток в 200 мкл буфера сортировщикФер. Передача клеток в 1,2 мл микропробирок FACS. Промойте трубку с еще 200 мкл буфера сортировки и бассейн в тот же микропробирок. Если в ячейке скопления очевидны, проходят клетки через 50 мкм фильтр.
8. Для фракция несвязанного и компенсаций управления, переливать или аспирации супернатант и ресуспендируют в 2 мл буфера сортировки.
9. Настройка цитометра использованием одного цвета контроля компенсации. Выберите сторону разброса ширины (SSC-W) в качестве дополнительного параметра для записи.
10. Анализ окрашенных образцов с использованием последовательности последовательных ворот включения для определения CD4 + и CD8 + Т-клеток, как показано на рисунках 1 и 2. Для связанных фракций, собирать столько ячеек, сколько возможно до максимума 2000000 Всего событий. Для несвязанных фракций, собрать 1.000.000 общего событий. Держите скорость сбора данных на уровне или ниже 3000 событий в секунду.
11. Используя те же настройки машины, анализировать считая шарик образцов. Соберите 10000 Всего событий.
12. Сохранить все данные в виде файлов FCS.

5. Анализ данных

1. Анализ FCS файлы данных для подсчета борта образцов с использованием FlowJo программного обеспечения. Участок рассеяния вперед по FITC и установить ворота aroung считая бусины (рис. 1 и 2). Определите общее количество считая бусины обнаружены в каждом образце. Вычтем из общего количества собранных событий, чтобы определить количество клеточных событий, собранных.
2. Рассчитайте общее число всех клеток в каждом образце с помощью уравнений, изложенные во вставке 1.
3. Анализ FCS файлы данных для окрашенных связанных и несвязанных образцов фракции. Настройка последовательности последовательных ворот включения для выявления лимфоидной +, побочные разброс ширины ^вот, самосвалы, CD3 +, CD4 + и CD8 +, тетрамер + Т-клеток в каждом образце, как показано на рисунках 1 и 2.
4. Умножьте общее количество клеток в образце частоты каждого включения ворота используются для определения CD4 + тетрамер+ Или CD8 + тетрамер + клеток для расчета общего количества эпитопов Т-клеток (вставка 1).

Результаты

На рисунке 1 показана представитель проточной цитометрии участков pMHCII тетрамер обогащенных образцов селезенки и лимфатических узлов от наивных мышей, а на рисунке 2 показаны репрезентативные данные для мышей, иммунизированных ранее с соответствующим пептидом + CFA. С?...

Обсуждение

ПКИКЖ тетрамера на основе метода обогащения клетки представленные этого протокола является мощным инструментом для изучения эпитоп-специфических Т-клеток от эндогенных T репертуар клетки. Использование тетрамеров ПКИКЖ позволяет обнаруживать эпитоп-специфических Т-клеток основан ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ЧП или APC сопряженных ПКИКЖ тетрамер (или мультимер)	Сделано следователя, полученные из основных НИЗ тетрамера, или приобретенные из коммерческих источников
Anti-PE сопряженных магнитных микросфер	Miltenyi	130-048-801
Anti-APC сопряженных магнитных микросфер	Miltenyi	130-090-855
LS магнитного столбцов	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS или QuadroMACS магнит	Miltenyi	130-042-302 или 130-090-976
Бисером подсчета клеток	Life Technologies	PCB-100