Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo

Resumen

Este protocolo describe el uso de péptido: MHC tetrámeros y microperlas magnéticas para aislar poblaciones de baja frecuencia de células T específicos para el epítopo y analizarlas por citometría de flujo. Este método permite el estudio directo de sus propias poblaciones de células T de interés de In vivo Los sistemas experimentales.

Resumen

Una necesidad básica para los investigadores que estudian la inmunidad adaptativa con modelos experimentales in vivo es la capacidad de identificar las células T en función de su receptor de antígeno de células T (TCR) especificidad. Muchos métodos indirectos están disponibles en el que una población mayor de células T se estimularon in vitro con un antígeno específico y el epítopo de células T específicas se identifican a través de la medición de una respuesta funcional, tal como la proliferación, producción de citoquinas, o la expresión de marcadores de activación ^1. Sin embargo, estos métodos sólo identificar epítopos de células T específicas que presentan una de las muchas posibles funciones, y que no son lo suficientemente sensibles como para detectar epítopos de células T específicas en las frecuencias precursoras ingenuas. Una alternativa popular es el modelo de transferencia adoptiva TCR transgénico, en la que las células T monoclonales de un ratón TCR transgénico se siembran en hosts histocompatibles para crear una población grande precursor de células T específicos para el epítopo que pueden ser easiLy seguido con el uso de un anticuerpo marcador congenic ^2,3. Mientras potente, este método adolece de artefactos experimentales asociados con la frecuencia no fisiológica de las células T con especificidad para un epítope ^4,5 sola. Además, este sistema no se puede utilizar para investigar la heterogeneidad funcional del epítopo específicos de clones de células T dentro de una población policlonal.

La forma ideal para estudiar la inmunidad adaptativa debe implicar la detección directa de epítopo de células T específicas del repertorio de células T endógeno utilizando un método que distingue la especificidad TCR únicamente por su unión a péptido cognado: complejos de MHC (pMHC). El uso de tetrámeros y citometría de flujo pMHC logra esto ^6, pero se limita a la detección de poblaciones de alta frecuencia de células T específicos para el epítopo que sólo se encuentran siguiente inducida por antígeno expansión clonal. En este protocolo, se describe un método que coordina el uso de tetrámeros pMHC y magnetic tecnología de enriquecimiento de células para permitir la detección de células de frecuencia extremadamente baja T específicos para el epítopo de los tejidos linfoides de ratón ^3,7. Con esta técnica, se puede realizar un seguimiento integral enteros específicos de epítopo poblaciones endógenas de las células T en ratones en todas las etapas de la respuesta inmune.

Protocolo

1. Aislamiento de células del tejido linfoide

1. Añadir 1 ml de hielo frío cEHAA (EHAA + 10% de FBS, penicilina / estreptomicina, gentamicina, 2 mM de L-glutamina, 55 mM de 2-mercaptoetanol) u otro medio equivalente de las células T, a una placa de cultivo de 60 mm que contiene un pequeño cuadrado de 100 micras de malla de nylon y colocar en hielo.
2. Eutanasiar ratón.
3. Retire el bazo y como muchos nodos linfáticos fácilmente accesibles como sea posible. Estos deben incluir al menos las inguinales, axilares, ganglios linfáticos cervicales, braquial, y mesentérica. Colocarlos en la parte superior de la malla de nylon en la placa de cultivo.
4. Usando la parte superior plana cerrada de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, suavemente mezcla el tejido linfoide sobre la malla de nylon para liberar a los linfocitos. Añadir otra ml de 1 cEHAA y pipetear hacia arriba y hacia abajo para trabajar las células en una suspensión. Transferir las células a través de otra pieza de malla de nylon coloca sobre la parte superior de un tubo de centrífuga de 15 ml de polipropileno. Enjuagar la cápsula y de malla con otro 1 ml de hielo frío cEHAA, poOling los volúmenes en el mismo tubo. Repetir para conseguir un volumen de suspensión celular final de 4 ml.
5. Añadir tampón clasificador de frío (PBS + 2% de FBS, 0,05% de azida) hasta un volumen final de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C.
6. Aspirar con cuidado el sobrenadante, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en Fc bloque (clasificador de tampón + 2.4G2 anticuerpo) a un volumen final igual a aproximadamente el doble de la del propio gránulo. Por ejemplo, el bazo y nódulos linfáticos de un ratón naive por lo general produce un sedimento celular de aproximadamente 100 l. En este caso, añadir 100 ml de bloque Fc para llevar el volumen a 200 l. Si un alto grado de aglutinación de células se ha producido, retirar cuidadosamente el agregado celular en este punto con una punta de pipeta.

2. Tetramer tinción

1. Añadir PE-o APC marcada con pMHC tetrámero a una concentración final de 10 nM (o concentración empíricamente optimizado).
2. Mix and incubaciónTE durante 1 hora a temperatura ambiente (o tiempo empíricamente optimizado y temperatura).
3. Añadir tampón clasificador de frío hasta un volumen de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. Mantener las muestras en hielo oa 4 ° C a partir de ahora.
4. Aspirar con cuidado el sobrenadante, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en tampón clasificador para un volumen final de 200 l. Para el enriquecimiento tetrámero doble, resuspender hasta un volumen final de 150 l.

3. Enriquecimiento magnética

1. Añadir 50 l de microperlas Miltenyi anti-PE o anti-APC. Para el enriquecimiento tetrámero doble, se añaden 50 l de ambos.
2. Mezclar e incubar durante 20 min a 4 ° C.
3. Añadir tampón clasificador de frío hasta un volumen de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C.
4. Mientras se espera, configure una columna Miltenyi LS magnético en un imán midiMACS o QuadroMACS. Posicionar un abierto 15 ml de polipropileno en un tubo de centrífugaacumular directamente debajo de la columna.
5. Añadir 3 ml de tampón clasificador a la parte superior de la columna, lo que permite que se drene en el tubo de 15 ml.
6. Colocar un nylon 100 micras de malla cuadrada en la parte superior de la columna.
7. Cuando las células han terminado de hilado, aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender el sedimento en 3 ml de tampón clasificador.
8. Transferir la suspensión celular a través de la malla de nylon en la parte superior de la columna.
9. Cuando la suspensión de células se haya vaciado completamente en la columna, enjuagar el tubo original con otro ml de tampón 3 clasificador y transferir el tampón a través de la malla de nylon en la columna, lavar la malla en el proceso. Deseche la malla de nylon.
10. Cuando la memoria intermedia se haya vaciado completamente en la columna, añadir otro 3 ml de tampón clasificador a la columna.
11. Repetir el paso 10 para un total de 3 x 3 lavados ml.
12. Retirar la columna del imán y colocada en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml de polipropileno.
13. Añadir 5 ml de tampón clasificador para tél columna.
14. Inmediatamente inserte el émbolo en la parte superior de la columna y en un movimiento continuo, empuje el émbolo hacia abajo, forzando el tampón de la columna en el tubo.
15. Centrifugar los tubos que contenían la fracción eluida unida y la fracción no unida de flujo a través durante 5 min a 300 xg, 4 ° C.
16. Aspirar con cuidado el sobrenadante de la fracción unida, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en tampón clasificador para un volumen final de 95 l exactamente. Aspirar y volver a suspender la fracción no unida a un volumen final de 2 ml.

4. Citometría de Flujo

1. Para cada fracción, quitar 5 l y añadir a 200 l de perlas de conteo (ajustado a una concentración de 200.000 / ml en tampón clasificador) en un tubo de 5 ml FACS. De lado a 4 ° C para su posterior análisis. Para ahorrar tiempo, los granos pueden ser pre-alícuotas a tubos etiquetados antes del comienzo del experimento.
2. Preparar amaster mezcla de anticuerpos para teñir los marcadores de superficie en las células (Tabla 1). Para ahorrar tiempo, esto se puede hacer antes del comienzo del experimento.
3. Para la fracción unida, añadir una dosis de cóctel de anticuerpos directamente al ~ 90 l de células en el tubo. Si el análisis de la fracción no unida se desea, transferir 90 l de células a un tubo de 5 ml FACS y añadir una dosis de cóctel de anticuerpos.
4. Crear un panel de controles de compensación de un solo color para el citómetro de flujo. Para cada fluorocromo a utilizar, mezclar 50 l de células sobrantes fracción no unida en un tubo de 5 ml FACS con 1 l de anticuerpo anti-CD4 conjugado con el fluorocromo correspondiente. Recuerde que debe establecer un control sin mancha también.
5. Agitar e incubar las muestras durante 30 min a 4 ° C.
6. Añadir 5 ml de tampón clasificador a cada tubo y centrifugar durante 5 min a 300 xg, 4 ° C.
7. Para la fracción unida, aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender las células en 200 l de buf clasificadorfer. Transferir las células a un microtubo de 1,2 ml FACS. Enjuague el tubo con otro 200 l de tampón clasificador y la piscina en el mismo microtubo. Si los agregados celulares son evidentes, pasar las células a través de un filtro de 50 micras.
8. Para la fracción no unida y controles de compensación, decantar o aspirar el sobrenadante y se resuspende en 2 ml de tampón clasificador.
9. Configurar el citómetro de flujo utilizando los controles de compensación de un solo color. Seleccione el lado de dispersión de ancho (SSC-W) como un parámetro adicional que desee grabar.
10. Analizar las muestras teñidas utilizando una secuencia de puertas de inclusión sucesivas para identificar CD4 + o CD8 + células T como se ilustra en las Figuras 1 y 2. Para las fracciones consolidados, recoger las células tanto como sea posible hasta un máximo de 2.000.000 de eventos totales. Para las fracciones no unidas, recoger 1.000.000 eventos totales. Mantener la velocidad de adquisición en o debajo de 3.000 eventos por segundo.
11. Uso de los ajustes de la máquina misma, analizar las muestras de conteo de cuentas. Recoge un total de 10.000 eventos.
12. Guarde todos los datos como archivos de FCS.

5. Análisis de Datos

1. Analizar FCS archivos de datos para las muestras de recuento de talón utilizando software FlowJo. Parcela dispersión frontal por FITC y configurar una puerta aroung las perlas de recuento (véanse las Figuras 1 y 2). Determinar el número total de recuento de granos detectados en cada muestra. Restar de la cantidad total de eventos recogidos para determinar el número de eventos celulares recogidas.
2. Calcule el número total de todas las células en cada muestra utilizando las ecuaciones descritas en el Cuadro 1.
3. Analizar FCS archivos de datos de las muestras teñidas fracción unida y no unida. Configurar una secuencia de puertas de inclusión sucesivas para identificar + linfoide, ^lo lado de ancho de dispersión, vertimiento, CD3 +, CD4 + o CD8 +, tetrámero + células T en cada muestra como se ilustra en las Figuras 1 y 2.
4. Multiplicar el número total de células en la muestra por las frecuencias de cada una de las puertas de inclusión utilizados para definir CD4 + tetrámero+ O CD8 + tetrámero + células para calcular el número total de epítopos de células T específicas (Cuadro 1).

Resultados

La Figura 1 muestra representativas parcelas de citometría de flujo de pMHCII tetrámero bazo enriquecidos y muestras de ganglios linfáticos de ratones sin tratamiento previo, mientras que la Figura 2 muestra los datos representativos de ratones previamente inmunizados con el péptido relevante + CFA. Gating serie elimina eventos no deseados autofluorescentes y otro a partir del análisis de las células CD4 + T poblaciones celulares. El CD8 + población de células T sirve como un co...

Discusión

El pMHC tetrámero basado en el método de enriquecimiento de células presentada por este protocolo es una poderosa herramienta para el estudio de epítopo de células T específicas de repertorios de células T endógenas. El uso de tetrámeros de pMHC permite la detección de células T específicos para el epítopo basado directamente en la capacidad de sus TCR para unir ligandos cognados pMHC. El enriquecimiento proporciona un nivel de sensibilidad de tal manera que las poblaciones extremadamente raros de antígeno...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE o APC conjugado tetrámero pMHC (o multímero)	Fabricado por investigador, obtenido a partir del núcleo NIH tetrámero, o adquiridos de fuentes comerciales
Anti-PE microbolas magnéticas conjugadas	Miltenyi	130-048-801
Anti-APC microesferas magnéticas conjugadas	Miltenyi	130-090-855
Ls columnas magnéticas	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS o imán QuadroMACS	Miltenyi	130-042-302 o 130-090-976
Cuentas de recuento celular	Life Technologies	PCB-100