ضوء الفحص ميول لدراسة الساعة البيولوجية الفطرية وPhotobehavior الخاضعة للرقابة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Summary

نحن هنا وصف اختبار تفضيل ضوء الظلام ليرقة ذبابة الفاكهة. ويوفر هذا الاختبار معلومات حول تنظيم الساعة البيولوجية الفطرية والضوء photobehavior الاستشعار عن بعد ومعالجة.

Abstract

أعمال خفيفة مثل إشارة البيئية للتحكم في سلوك الحيوان على مختلف المستويات. ويستخدم الجهاز العصبي اليرقات ذبابة الفاكهة كنموذج فريد للإجابة على الأسئلة الأساسية حول كيفية معالجة المعلومات الخفيفة ومشتركة بين السلوكيات السريع والإيقاعية. يرقات ذبابة الفاكهة عرض سلوك التهرب النمطية عند تعرضها للضوء. للتحقيق في التصرفات تعتمد على الضوء ويمكن تطبيق اختبارات بسيطة نسبيا تفضيل ضوء الظلام. في الفقاريات والمفصليات المسارات العصبية المشاركة في الاستشعار عن بعد ومعالجة المدخلات البصرية تتداخل جزئيا مع تلك معالجة المعلومات الإيقاعية ضوئي. مسألة رائعة لكيفية عمل نظام الاستشعار ضوء ونظام الساعة البيولوجية التفاعل للحفاظ على النواتج السلوكية تنسيق يبقى غير مستكشفة إلى حد كبير. ذبابة الفاكهة هو نموذج التأثير البيولوجي لنهج هذه الأسئلة، ويرجع ذلك إلى عدد صغير من الخلايا العصبية في الدماغ، ومدى توافر الأدوات الوراثية لmanipul العصبيةأوجه. وقدم ضوء الظلام مقايسة تفضيل يسمح التحقيق في مجموعة من السلوكيات البصرية بما في ذلك السيطرة الإيقاعية من انجذاب ضوئي.

Introduction

هنا نحن تصف مقايسة السلوكية على أساس تفضيل اليرقات لمظلمة (أو الضوء). اليرقات تتفاعل مع استجابة قوية والنمطية سلبي ضوئي خلال مراحل تستخدم علفا (L1 إلى L3 في وقت مبكر) ^1. ويهدف الفحص لتقييم السلوك رهاب الضوء من اليرقة ويقارن تفضيل الضوء أو الظلام لمجموعة من اليرقات تتحرك بحرية في طبق بتري المغلفة مع أجار. هذا الاختبار السلوكية يوفر معلومات حول حساسية، والتكامل والزمانية اللدونة من النظام البصري ليس فقط ذلك، فإنه يوفر المزيد من التلميحات حول كيفية التحكم في الحساسية للضوء وعملية من قبل نظام الساعة البيولوجية.

ذبابة الفاكهة اليرقات العين (أيضا يطلق Bowlig الجهاز؛ BO)، هو الجهاز الرئيسي للضوء التصور. وتتكون كل عين من 12 مبصرات (PR)، وثمانية المستفيدين الرئيسيين تعبر عن rhodopsin6 حساسة الخضراء (RH6) وأربعة المستفيدين الرئيسيين تعبر عن rhodopsin5 حساسة الأزرق (RH5) ^2،3. بالإضافة إلى المستفيدين الرئيسيين، ALSوقد تم تحديد فئة O IV الخلايا العصبية multidendritic، التي تغطي جدار الجسم اليرقات، للاستجابة لشدة الضوء الضارة ^4،5. ومن المعروف أيضا أن الخلايا العصبية جهاز تنظيم ضربات القلب تقع في وسط الدماغ اليرقات تعبر عن ضوء حساسية البروتين Cryptochrome (صرخة) الذي يقوم بدور جوهري على مدار الساعة استشعار الضوء الأزرق داخل الدماغ ^6،7. يثير الاهتمام والفضول photophobicity من الحيوانات البرية نوع يظهر عنصر الإيقاعية في نقاط زمنية مختلفة في أثناء النهار والليل عند اختبار مع هذا الاختبار. وأظهرت الردود على ضوء تستخدم علفا L3 يرقة photophobicity أقوى عند الفجر وعند الغسق photophobicity أقل عند اختباره لتفضيل ضوء الظلام ^7. ومن المثير للاهتمام ومطلوبة فقط RH5-PRS لتجنب ضوء، في حين RH6-PRS يمكن الاستغناء عنها. تشارك كل من، RH5-PRS وRH6-PRS في إعادة عقارب الساعة الجزيئية التي كتبها ضوء ^8. يجب تنسيق مسار صرخة مع مسارات الاستشعار الخفيفة الأخرى إلى تنسيق الإخراج السلوكية المناسبة فيمدار اليوم. أستيل في المستفيدين الرئيسيين يلعب دورا أساسيا في سلوك التهرب ضوء وكذلك الرائعة على مدار الساعة الجزيئية. حجب العصبي أستيل من المستفيدين الرئيسيين لتنظيم ضربات القلب الإيقاعية الخلايا العصبية يقلل من استجابة رهاب الضوء في ضوء الظلام تفضيل مقايسة ^8. توظيف نفس الفحص، وقد تم تحديد اثنين من أزواج متماثلة من الخلايا العصبية في الآونة الأخيرة لتبديل تفضيل ضوء الطور اليرقي الثالث من ذبابة الفاكهة ^9. هذه الأزواج اثنين من الخلايا العصبية يمكن أن تعمل خلال مراحل اليرقات في وقت متأخر، عندما ترك الحيوانات الطعام إلى يفترض إيجاد موقع pupariation المناسبة. ومع ذلك، فإن مسألة كيفية تفاعل المسارات البصرية والتحكم في سلوك اليرقات البصرية بطريقة الإيقاعية لا يزال لم يتم الرد عليها إلى حد كبير. مقايسة تفضيل ضوء يسمح مقارنات بين نقاط الوقت الإيقاعية، ويطير الخطوط والدولة الإيقاعية تحت ضوء مختلف الصفات. الفحص هو تحضيرها بسهولة وغير مكلفة وكانت مفيدة سابقا أنان عدة مختبرات لوصف ودراسة سلوك الضوء المستمدة في اليرقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تربية اليرقات

1. الحفاظ على السلالات يطير أو الصلبان الجينية في الثقافة الجماهيرية عند 25 درجة مئوية في المتوسط ​​وجبة الذرة تحت ضوء-12-HR دورة 12 ساعة مظلمة في ذبابة حاضنة مجهزة ضوء وموقت.
2. تمييع الداعم الخميرة في الماء لتكوين عجينة السوائل (10 غرام من الخميرة الداعم المخفف مع 3-4 مل المقطر H ₂ O). إضافة قطرة صغيرة إلى الذرة وجبة الغذاء وتغطية قارورة. اسمحوا الجافة لمدة ساعة واحدة على الأقل لتجنب الذباب الكبار التمسك عجينة الخميرة. يمكن وضع قطرة صغيرة من الخميرة المخفف في الماء على سطح الطعام تعزيز وضع البيض. وبدلا من بيكر خميرة عجينة، وحامض الخليك 20٪ (AcOH) (سيغما الدريتش، سويسرا A6283-100ML) يمكن استخدامها. لهذا، وتراجع غيض من Q-تلميح على حل وانتشارها على السطح وجبة الذرة الغذاء.
3. وضع الذباب الكبار (أربعة أيام على الأقل من العمر، ولكن لا يزيد عمرها عن عشرة أيام) في الذرة وجبة الغذاء قارورة. وضع ما يكفي من البالغين في كل قارورة من أجل الحصول على يرقات كافية لتكرار تفضيلاختبار عدة مرات، والسماح المقارنة الإحصائية. لالصلبان الجينية، ونحن عادة استخدام الحد الأدنى من 20 الإناث والذكور 5-10 في قارورة، ولكن بعض الخطوط تتطلب المزيد من الإناث للحصول على ذرية اليرقات كافية.
4. تسمح البالغين لوضع البيض لمدة 12 ساعة ونقلها إلى قارورة جديدة. يمكن نقل البالغين في الصباح والمساء. ونحن عادة نقل البالغين لمدة سبعة إلى عشرة أيام، وإذا لزم الأمر تأخذ البالغين الجديدة.
5. الحفاظ على مجموعات البيض تؤخذ كل 12 ساعة في الحاضنة والسماح تنمو اليرقات في 25 ° C، 12 ساعة ضوء 12 ساعة دورة الظلام والرطوبة 60٪. لاختبار مكونات الساعة البيولوجية للسلوك البصرية تمر اليرقات إلى ظلام مستمر (DD) 48 ساعة بعد جمع البيض (المقابلة لدورات مدتها ضوء الظلام). لهذا، استخدم حاضنة منفصلة من دون ضوء ولكن تبقى جميع الشروط الأخرى مثل درجة الحرارة والرطوبة متطابقة. تأكد من نقل قنينات إلى DD حاضنة فقط قبل التحول إلى مرحلة مظلمة. قبل أن ينتقل إلى قارورة عنوتوضع إيه حاضنة قارورة في صندوق من الورق المقوى أو التفاف قارورة مع رقائق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء أثناء نقل (التعبئة والتغليف في صندوق من الورق المقوى أو التفاف الذي ينبغي القيام به خلال "أضواء على مرحلة" قبل التحول بين الحاضنات). منع الحيوانات من أي التعرض للضوء بعد هذه النقطة وحتى بداية التجارب.
6. بعد 4 أيام (84-108 ساعة من وضع البيض) جمع في وقت مبكر L3 (اليرقات التغذية) في نقاط زمنية لفحصها (انظر 4. اختبار تفضيل الضوء، نقطة. 4.4).

2. إعداد اختبار

1. إجراء تجارب في غرفة مظلمة مع درجة حرارة ثابتة وظروف الرطوبة.
2. للحفاظ على اثنين من الأرباع طبق بيتري في الظلام، تغطية غطاء مع الشريط الأسود ورقائق الألومنيوم. من أجل القيام بذلك، بمناسبة وسط محيط الغطاء. أيضا علامة أربع نقاط في الحدود من الغطاء مع 90 درجة من الفصل بينهم. لجعله أسهل، رسم 20 سم مربع مقسمة في أربعة أجزاء 10 سم على طولورقة من الورق أو مع مساعدة من جهاز الكمبيوتر. قطع 10 سم الساحات من رقائق الألومنيوم والشريط الأسود (الشكل 1A). تغطية اثنين من الأرباع المعاكس من قبل الإلتصاق مربع من رقائق الألومنيوم، والطبقة الأولى وشريط أسود يغطي عليه، وتوخي الحذر ليشمل أيضا الحدود من الغطاء.
   في الماضي كانت تستخدم شكلين مختلفين قليلا من هذه المقايسات. نحن هنا استخدام "ربع لوحة" الفحص، التي تنقسم طبق بيتري في أربعة أرباع متساوية ^10. في البديل "نصف لوحة" مقايسة ينقسم طبق بيتري نصف (نصف تتعرض للضوء، ونصف في الظلام) ^1،7،8. حتى اليوم تم نشر عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المقايسات اثنين.
3. الغراء ورقة رباعي مثل تلك المستخدمة لوسم الأغطية الحق تحت مصدر الضوء على الطاولة. بمناسبة محيط من طبق بيتري تركزت على تقاطع الأرباع. استخدام علامات كمرجع لوضع لوحة اختبار دائما في نفس الموقف تحت مصدر الضوء.
4. تثبيتمصباح، إما بسيطة لمبة الضوء الأبيض (فيليبس، Softtone 5W) أو مصباح LED (LED مصباح، 80012 الأبيض، أوسرام) فوق طبق بيتري مع مساعدة من موقف الدعم الحديد (فيشر العلمية، S47808). ضبط ارتفاع في هذه الطريقة أن لوحة الاختبار كله مضاءة متجانس. ونحن نوصي بشدة استخدام مصابيح LED لأنها تنبعث منها موجات أكثر تحديدا من المصابيح التقليدية. وعلاوة على ذلك المصابيح تنبعث منها حرارة أقل.
5. ضبط شدة الضوء مع مساعدة من مقياس ضوئي (البيئة متر PCE EM882). لتحقيق كثافة الضوء المطلوب من 350-760 لوكس، نقل مصباح أعلى أو لأسفل على النحو المطلوب. توصيل مصباح إلى مصدر طاقة قابل للتعديل يعطي مزيدا من المرونة لتغيير شدة دون تحريك مصباح (1B الشكل).

3. لوحات إعداد

1. جعل 200 مل من 2.5٪ أجار (سيغما الدريخ، سويسرا A5093-500G) مع الماء المقطر مزدوجة (ميليبور).
2. وضع أطباق بتري على طاولة (90 ملم قطر؛غرينر بيو واحدة محدودة، 4550 Kremsmeinster، النمسا) في الصفوف للسماح صب الساخنة الاغاروز.
3. غلي الاغاروز في الميكروويف حتى الحل هو شفاف تماما والسوائل. تأكد من أن المحلول السائل لا يحتوي على فقاعات. تنبيه: النقل بعناية الى طاولة المفاوضات لأن الحل يمكن أن تكون ساخنة جدا!
4. صب الساخنة الاغاروز في أطباق بتري حتى يتم تغطية السطح كله متجانس مع طبقة رقيقة من الحل، عن اثنين أو ثلاثة ملليمترات ما يكفي. أن تكون سريعة لمنع الاغاروز ترسيخ قبل طلاء جميع لوحات. السماح لوحات يبرد. تخزين لوحات في درجة حرارة الغرفة واستخدامها فقط في نفس اليوم من التحضير.

4. ضوء اختبار ميول

1. العمل في ظل ظروف الضوء الأحمر في غرفة التجربة لمنع تأثير ضوء قبل الاختبار منذ ذبابة الفاكهة ليست قادرة على الاحساس الأطوال الموجية من الضوء الأحمر. استخدام لمبة الضوء الأحمر (فيليبس، PFE712E * 8) شنت في مصباح لإضاءة رانه مكان للعمل.
2. الحفاظ على درجة حرارة من خلال كل التجارب عند 25 درجة مئوية. مراقبة درجة حرارة الغرفة عن طريق جهاز سخان أو التبريد إذا لزم الأمر.
3. تأخذ بعض الطعام من قوارير تربى لدورات لمدة يومين تحت ظلام مستمر (من الباب 1). منذ اليرقات عادة ما يتم حفر على سطح المواد الغذائية، واتخاذ الطبقة العليا (حوالي 5 ملم العميق) مع مساعدة من ملعقة (فيشر العلمية، 14-373-25A). انتشار الطعام على الجانب الخارجي لغطاء طبق بتري، وإضافة بعض الماء وتخلط بلطف مع ملعقة.
4. جمع تغذية اليرقات L3 من الطعام. كما وسيتم اختبار تفضيل ضوء، واختيار فقط في وقت مبكر / التغذية L3 اليرقات أمر بالغ الأهمية نظرا لأنه أكد للانجذاب ضوئي سلبية. المرحوم / تجول L3 اليرقات أو يرقة كبيرة الزحف على الطعام يفترض تحولت بالفعل photobehavior بهم. ويمكن التعرف على تغذية اليرقات L3 (ضوئية سالبة) لأن الفتحات التنفسية الخاصة بهم الأمامية مفتوحة ويبرز إلى الخارج في شكل الإصبع تشبه. وشق الخلفيليالي لديها ثلاث فتحات لكل منهما، وأربع مجموعات من الشعر متفرعة كبير. الغدد اللعابية تمتد إلى الجزء الثاني البطن ^11. انطلاق اليرقة تحت المجهر مريحة في حين عدم وجود ضوء أبيض ينبغي استخدامها. A مصباح الضوء الأحمر هو ضروري لإلقاء الضوء على يرقات إذا التدريج تحت المجهر مجسمة قبل مطلوب التجارب.
5. غسل اليرقات لفترة وجيزة في ماء الصنبور، وجمع في وقت مبكر، تغذية اليرقات طور مرحلي الثالثة (لا يزال في الضوء الأحمر). قبل نقل اليرقات إلى لوحة الاختبار، واتخاذ اليرقات مع الرسام الرطب وامتصاص المياه الزائدة بعناية مع منشفة ورقية أو ورق الترشيح. لا تجف اليرقات بشكل مفرط للغاية لأنه يمكن أن يؤذي الحيوان والتأثير على سلوكها.
6. باستخدام فرشاة الرسام الرطب بعناية نقل اليرقات إلى لوحات. وضع مجموعة من حوالي 30 اليرقات في وسط اللوحة. تغطية لوحة مع غطاء أعدت بالفعل مع الأرباع وتعيين لوحة تحت مصدر ضوء استعداد لتجربة (انظر ثانيةنشوئها 2).
7. تشغيل مصباح الضوء الأبيض وبدء موقت. السماح لليرقة التحرك بحرية على لوحة لمدة 5 دقائق، ثم بسرعة إزالة الغطاء وحساب عدد اليرقات في الظلام والضوء في الأرباع. يمكن وسم موقف كل يرقة مع علامة تخفيف العد. وبدلا من التقاط صورة للوحة والاعتماد لاحقة. اليرقات تظهر تفضيل ضوء غير واضحة، مثل اليرقات الزحف على الجدران أو تختبئ في أجار ينبغي اعتبار تفضيل محايد ومجرد إدراجها في عدد من اليرقات عندما يتم حساب مؤشر تفضيل ضوء.
8. بعد العد، وتجاهل لوحة مع اليرقات واستبدالها مع لوحة اختبار جديد للتجربة القادمة. جمع لوحات المستخدمة في كيس من البلاستيك الأوتوكلاف في وقت لاحق المناولة والتخلص منها.
9. وبمجرد الانتهاء من إجراء عدد كاف من التجارب يمكن اختبار تركيب وراثى جديد. 10-15 المحاكمات في التركيب الوراثي كافية للتحليل.

5. s تحليل البياناتق

1. لراحة نقل البيانات إلى ورقة بيانات وإكسل (مايكروسوفت) أو المنشأ (معمل المنشأ) على جهاز كمبيوتر لمزيد من التحليل الإحصائي. ترتيب في عمود واحد على عدد من الحيوانات في الظلام، في العمود الثاني عدد الحيوانات في الأرباع ضوء وفي الثالث الكلي للحيوانات في لوحة (بما في ذلك اليرقات "محايدة").
2. حساب مؤشر تفضيل (PREF) للظلام لكل تجربة باستخدام الصيغة التالية:
   PREF (الظلام) = (عدد اليرقات في الظلام - عدد اليرقات في ضوء) / العدد الإجمالي لليرقات
3. قارن إحصائيا مجموعة من البيانات مع تحليل المناسبة للمجموعات. هنا، ونحن نستخدم اختبار يلكوكسون لمقارنة إحصائية مجموعتين. اختبار ANOVA مع متعددة مقارنة لتوكي اللاحق يمكن أن يتم الاختبار، وإذا تم الوفاء افتراض التوزيع الطبيعي في مقارنة مجموعة متعددة.
4. جعل الرسوم البيانية التي تظهر بوضوح مقارنات بين الخطوط والنقاط الزمنية على طول دورة يوم. Wه استخدام البرامج الأصلية (مختبر المنشأ) لاختبار دلالة إحصائية وتوليد الرسوم البيانية المناسبة، ولكن أي برنامج إحصائية أخرى يمكن أن تكون مفيدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بعد بروتوكول الموصوفة أعلاه، ونحن اختبار تفضيل ضوء الظلام في وقت مبكر ملعب اليرقات الثالثة من النوع البري كانتون-S تطير في اثنين من مختلف الأوقات الإيقاعية CT0 وCT12. وقد تربى البالغين 12 ساعة ضوء-12-HR الظلام وغادر لوضع البيض لمدة 12 ساعة. اليرقات تنمو في أول يومين في إطار نف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

اختبار تفضيل ضوء صفها يستفيد من photobehavior الفطرية اليرقات. مقايسة من السهل أن تنشئ، يسمح بالكثير من التكرار بتكلفة منخفضة وتوفر معلومات قيمة حول الاستشعار عن الضوء والمعالجة. النموذج التجريبي يسمح الكمي السريع نسبيا عن كيفية العديد من الأفراد يفضلون الضوء أو الظلام. ي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	A5093-500G	2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland
Petri dishes	Greiner Bio-One GmbH	633180	90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria
LEDs Lamp	OSARAM	80012 White	LED lamp, 80012 White
Environment Meter	PCE	PCE EM882	Lux, Temp, RH%
Thermostatic cabinet	Aqua Lytic (Liebherr)	ET636-6
Light timer	Timer T	6185.104	230V/50HZ (check specifications for your country)
Universal thermostat	Conrad	UT200
Humidifier	Boneco
Balck tape	Tesa		5 cm
Glue	Uhu
lncubator lamp	Phillips	Softtone	5W
Timer clock	Ziliss		Ziliss, Switzerland
Excel Software	Microsoft		Excel
Origin Software 8.5	OriginLab
Backer Yeast	Migros Switzerland
Iron support stand 17X28CM	Fisher Scientific	S47808
Acetic acid	Sigma Aldrich	A6283-100ML	20% acetic acid dilluted in H2O
Red light lamp	Phillips	PFE712E*8C
Spatula	Fisher Scientific	14-373-25A
Power supply	EA	EA PS 2042-06B	Optional
Aluminium foil	Prix Coop
Heater	GOON	NSB200C
Microwave Oven	Intertronic
Standard corn meal fly food
Destilled water