Içinde Doğuştan gelen ve sirkadiyen Ayarlı Photobehavior Eğitim ışık tercih Testi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Özet

Burada Drosophila larva için bir ışık-karanlık tercih testi açıklar. Bu testte ışık algılama ve işleme photobehavior doğuştan gelen ve sirkadiyen düzenleme hakkında bilgi sağlar.

Özet

Çeşitli düzeylerde hayvan davranışlarını kontrol etmek için çevresel sinyal olarak ışık görür. Drosophila larva sinir sistemi ışık bilgileri işleme ve hızlı ve sirkadiyen davranışları arasında paylaşılır nasıl temel sorulara cevap için eşsiz bir model olarak kullanılır. Işığa maruz kaldığında Drosophila larvaları basmakalıp bir kaçınma davranışı gösterir. Nispeten basit ışık-karanlık tercih testleri uygulanabilir ışık bağımlı davranışları araştırmak. Omurgalı ve eklembacaklılar görsel giriş algılama ve işleme dahil sinir yolları kısmen bu işleme fotik sirkadiyen bilgilerle örtüşmektedir. Işık algılama sistemi ve sirkadiyen sistem davranış çıkışları koordine tutmak için nasıl etkileşimde büyüleyici soru büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Drosophila beyindeki nöronların az sayıda nedeniyle bu sorulara yaklaşım bir etkileyen biyolojik modeli ve genetik araçları yer olduğunu nöronal dalavereler içintirme. Sunulan açık-koyu tercih tahlil phototaxis sirkadiyen kontrolü de dahil olmak üzere görsel davranışlar bir dizi soruşturma sağlar.

Giriş

Burada karanlık için larva tercih (veya hafif) dayalı bir davranış deneyi açıklar. Larva yiyecek arama aşamaları (erken L3 L1) ¹ sırasında güçlü ve stereotipik photonegative tepki ile tepki. Tahlil larva photophobic davranışlarını değerlendirmek amaçlanmıştır ve larvaları agar ile kaplı bir Petri kabındaki serbestçe hareket bir grup açık veya koyu tercih karşılaştırır edilir. Bu davranış tahlil görme sisteminin hassasiyeti, entegrasyon ve zamansal plastisite hakkında bilgi veren değil sadece, daha fazla ışık hassasiyeti ve süreci sirkadiyen sistemi tarafından kontrol edilir nasıl ipuçları sağlar.

Drosophila larva göz (da adlandırılır Bowlig Organ, BO), ışık hissi için ana organdır. Her göz 12 fotoreseptör (PR) oluşan, sekiz PR PR mavi duyarlı rhodopsin5 (RH5) ^2,3 ifade yeşil duyarlı rhodopsin6 (RH6) ve dört ifade. PR, ALS ek olarak,larva vücut duvarı kapsayacak o sınıf IV multidendritic nöronlar, zararlı ışık yoğunlukları ^4,5 yanıt tespit edilmiştir. Ayrıca merkezi larva beyinde yer alan kalp pili nöronların beynin ^6,7 içinde saat içsel mavi ışık sensörü gibi davranır ışığa duyarlı protein kriptokrom (Cry) ifade bilinmektedir. Bu testte ile test ederken ilgi çekici vahşi tip hayvanların photophobicity gün ve gece süresince farklı zaman noktalarında bir sirkadiyen bileşeni gösterir. Açık-koyu tercih ⁷ için test edildiğinde yiyecek arama L3 larva ışığında yanıtlarını alacakaranlıkta şafak vakti güçlü photophobicity ve alt photophobicity gösterdi. RH6-PR vazgeçilebilir ise İlginçtir sadece RH5-PR, ışık kaçınma için gereklidir. , RH5-PR ve RH6-PR hem ışık ⁸ ile moleküler saat sıfırlama olarak katılıyor. Cry yolu uygun bir davranış çıkış düzenlemek için diğer ışık algılama yolları ile koordine edilmelidirGünün tabii. PR asetilkolin ışık kaçınma davranışı hem de moleküler saat sürüklenmesi önemli bir rol oynar. PR dan sirkadiyen kalp pili nöronlara asetilkolin sinir iletimini engelleme ışık-karanlık tercih tahlil ⁸ photophobic yanıt azaltır. Aynı testi istihdam, nöronların iki simetrik çift son zamanlarda Drosophila ⁹ üçüncü larva ışığında tercihi değiştirmek için tespit edilmiştir. Hayvanlar muhtemelen uygun bir pupariation site bulmak için gıda ayrılırken nöronların Bu iki çift, geç larva aşamalarında çalışıyor olabilir. Ancak, görsel yollar etkileşim ve sirkadiyen bir şekilde larva görsel davranışlarını kontrol nasıl çoğaldığı sorusu cevapsız kalmıştır. Işık tercih testi sirkadiyen zaman noktaları arasında karşılaştırmalar, farklı ışık nitelikleri altında hatları ve sirkadiyen devlet sinek sağlar. Tahlil kolay hazırlanabilir ve ucuz ve ben daha önce yararlı olmuşturn birkaç laboratuarları tanımlamak ve larva ışık elde davranışlarını incelemek için.

Protokol

1. Larva Yetiştirme

1. ° C mısır unu orta ışık ve zamanlayıcı ile donatılmış bir sinek inkübatör 12 saat ışık-12-saat karanlık döngüsü altında 25 kitle kültüründe suşları veya genetik haçlar sinek tutun.
2. Bir sıvı hamur _(H2O damıtıldı 3-4 ml 'si ile seyreltildi destek komponenti maya, 10 g) oluşturmak için su içinde destekçisi maya seyreltilir. Mısır yemek yemek için küçük bir damla ekleyin ve şişeleri kapsar. Maya hamuruna yapışmasını yetişkin sinek önlemek için en az bir saat kuruması beklenir. Gıda yüzeyinde su ile seyreltilmiş maya, küçük bir damla koymak ovipozisyon artırabilir. Alternatif olarak fırıncı mayası hamur,% 20 asetik asit (AcOH) (Sigma Aldrich, İsviçre A6283-100 mi) de kullanılabilir. Bunun için, mısır yemek yiyecek yüzeyinde çözüm ve yayılması bir Q-ucu ucu daldırma.
3. Mısır yemek yiyecek şişeleri (daha eski on gün en az dört gün eski, ama değil) ergin sinek koyun. Tercih tekrarlamak yeterli larva elde etmek için her bir şişenin içine yeterince yetişkin koyunbirkaç kez test ve istatistiksel karşılaştırma sağlar. Genetik haçlar için, biz genellikle 20 kadın ve şişe başına 5-10 erkek en az kullanmak, ancak bazı çizgiler yeterli larva yavru elde etmek için daha fazla kadın gerektirir.
4. 12 saat için yumurtalarını bırakmak ve yeni şişeleri aktarmak için yetişkin izin verin. Yetişkinler sabah ve akşam aktarılabilir. Biz genellikle yedi ile on gün boyunca yetişkin aktarmak ve gerekirse yeni yetişkin alır.
5. Inkübatör her 12 saat alınan yumurta koleksiyonları tutun ve 25 larva ° C, 12-saat ışık-12-saat karanlık döngüsü ve% 60 nem büyümesine izin. Yumurta toplama sonra sürekli karanlıkta görsel davranış hareket larva (DD) 48 saat (iki açık-koyu döngüleri karşılık gelen) bir sirkadiyen bileşenleri test etmek için. Bunun için, ışık olmadan ayrı bir kuluçka kullanabilirsiniz ancak sıcaklık ve aynı nem gibi tüm diğer koşullar tutun. Sadece karanlık aşamasına geçiş önce DD inkübatör şişeleri aktarmak için emin olun. Anoth için şişeleri geçmeden önceer inkübatör bir karton kutu içinde şişeleri koymak veya aktarım sırasında ışığa maruz kalma (karton kutu ya da sarma paketleme kuluçka arasındaki geçiş için önce "ışık-on aşaması" sırasında yapılması gereken) önlemek için alüminyum folyo ile şişeleri sarın. Bu noktadan sonra ve deney başlangıcına kadar herhangi bir ışık maruz hayvanlar önleyin.
6. 4 gün sonra (yumurtlama 84-108 saat) (4 bakın. Işık tercih testi, nokta. 4.4.) Test edilecek zaman noktalarında erken L3 (beslenme larva) toplamak.

2. Deney Düzeneği

1. Sabit sıcaklık ve nem koşulları ile karanlık bir odada deneyler.
2. Karanlıkta Petri kabı iki kadran tutmak için, siyah bant ve alüminyum folyo ile kapağı kapatılır. Bunu yapmak için, kapağın çevresi ortasına işaretleyin. Ayrıca aralarında ayrılık 90 ° ile kapağın sınırında dört puan işaretleyin. Daha kolay hale getirmek için, bir 10 cm uzunluğunda dört kadran bölünmüş bir 20 cm kare çizmekkağıt veya bir bilgisayar yardımıyla sayfası. Alüminyum folyo ve siyah bant (Şekil 1A) 10 cm kareler kesin. Bu kapsayan ilk kat ve siyah bant gibi alüminyum folyo bir kare yapıştırma tarafından iki zıt kadran, Kapak, aynı zamanda kapağın sınır kapsayacak şekilde dikkatli olun.
   Geçmişte bu tahlillerin iki hafifçe farklı formu kullanılmıştır. Biz burada Petri kabı ¹⁰ dört eşit çeyrek ayrılmıştır hangi "Çeyrek plaka" testi, kullanın. Alternatif "yarı-plaka" tayininde Petri kabı bölünür yarısı (yarı ışık, karanlıkta yarım maruz) ^1,7,8. Bugüne kadar iki testleri arasında anlamlı bir fark yayınlandı.
3. Tutkal gibi sağ masaya ışık kaynağı altında kapak işaretleme için kullanılan biri olarak çeyrek sayfa. Kadran kavşak merkezli bir Petri kabı çevresi işaretleyin. Referans ışık kaynağı altında aynı pozisyonda her zaman test plaka yerleştirmek gibi işaretleri kullanın.
4. Bir yüklemelamba, ya basit bir beyaz ampul (Phillips, Softtone 5W) veya demir sopalı (Fisher Scientific, S47808) yardımıyla Petri kabı üzerinde bir LED lambası (LED lamba, 80012 Beyaz, Osram). Tüm test plakası homojen yandığından emin bir şekilde yüksekliğini ayarlayın. Onlar ampullere göre daha spesifik dalga yayan bu yana şiddetle LED lambaların kullanılmasını öneririz. Ayrıca LED daha az ısı yayarlar.
5. Bir fotometre (Çevre Metre PCE EM882) yardımı ile ışık yoğunluğunu ayarlayın. Gerektiği gibi 350-760 lux gerekli ışık yoğunluğu elde etmek için, yukarı lamba tutun veya aşağı. Ayarlanabilir bir güç kaynağına lamba takarak lambası (Şekil 1B) taşımadan yoğunlukları değiştirmek için daha fazla esneklik verir.

3. Tabaklar Hazırlık

1. Çift damıtılmış su (Millipore) ile% 2.5 ağar, 200 ml (Sigma-Aldrich, İsviçre A5093-500G) olun.
2. Bir tablo (90 mm çapına Petri kapları yerleştirin;Greiner Bio-One GmbH, satır 4550 Kremsmeinster, Avusturya) sıcak agaroz dökme izin vermek.
3. Çözüm tamamen şeffaf ve akışkan kadar bir mikrodalga agaroz kaynatın. Sıvı çözüm kabarcıkları içermediğinden emin olun. DİKKAT: dikkatle masaya Ulaştırma çözüm çok sıcak olabilir çünkü!
4. Bütün yüzeyi homojen bir çözelti ince bir tabaka ile kaplanana kadar Petri kaplarına sıcak agaroz dökün, iki ya da üç milimetre yeterlidir. Kaplama, tüm plakaları önce güçlendirilerek agaroz önlemek için hızlı olun. Plakaları soğumasını bekleyin. Oda sıcaklığında plakalar Mağaza ve sadece hazırlık aynı gün kullanabilirsiniz.

4. Işık Tercih Testi

1. Drosophila beri testi ışığın kırmızı dalga boyları anlamda mümkün değil önce ışık etkisini önlemek için deney odasında kırmızı ışık koşulları altında çalışmak. T aydınlatmak için bir lamba monte kırmızı bir ampul (Phillips, PFE712E * 8) kullanıno işe yerleştirin.
2. 25 tüm deneyler aracılığıyla sıcaklığını korumak ° C Bir ısıtıcı ya da soğutma cihazı vasıtasıyla kumanda oda sıcaklığında Gerekirse.
3. Sürekli karanlıkta altında iki günlük bir kür (Bölüm 1) için yetiştirilen şişeleri bazı yiyecek almak. Larvaları, genellikle gıda yüzeyinde kazma olduğundan, bir spatula (Fisher Scientific, 14-373-25A) yardımı ile en üst tabakası (yaklaşık 5 mm derinliğinde) alır. Bir Petri kabı kapağının dış tarafında gıda yayılmış, biraz su ilave edin ve bir spatula ile hafifçe karıştırın.
4. Gıda L3 larvaları besleme toplayın. Işık tercih test edilecektir gibi, olumsuz phototaxis güvence altına alınmıştır bu yana sadece L3 larvaları besleme / erken önemlidir seçerek. Dolaşıp / Geç gıda tarama L3 larva veya büyük larva muhtemelen zaten photobehavior açık. Onların ön spiracles açık ve bir parmak benzeri şeklinde dışarıya fırlamıştı çünkü besleme L3 larvaları (negatif phototactic) tanınabilir. Posterior spiracles üç açıklıklar her ve büyük dallı kılların dört grup var. Tükürük bezleri, ikinci karın segment ¹¹ uzanır. Hiçbir beyaz ışık kullanılmalıdır ise mikroskop altında larva Sahneleme uygundur. Bir kırmızı ışık lamba deneyler gereklidir önce stereoskopik mikroskop altında evreleme ise larva aydınlatmak için gereklidir.
5. Musluk suyunda kısa bir süre larva yıkayın ve erken-besleme üçüncü evre larvaları (hala kırmızı ışıkta) toplamak. Test plakasına larva aktarmadan önce, ıslak bir fırça ile larva almak ve bir kağıt havlu ya da filtre kağıdı ile aşırı su dikkatli bir şekilde emer. Bu hayvan zarar ve davranışlarını etkileyebilecek bu yana çok aşırı larvaları kurutmayın.
6. Islak fırça kullanarak dikkatle plakaları için larva transferi. Plakasının merkezinde yaklaşık 30 larvası bir grup yerleştirin. Kapak zaten kadran ile hazırlanan plaka ile örtün ve (bkz. deney için hazır ışık kaynağı altında plaka ayarlamaktion 2).
7. Beyaz ışık lambasını açmak ve Sayacı başlatmak. Larva 5 dakika plaka üzerinde serbestçe hareket edelim, sonra hızlı bir şekilde kapağı çıkarın ve karanlıkta ve ışık kadran içinde larva sayısını. Bir işaretleyici ile her larva konumunu işaretleme sayma azaltabilir. Alternatif plaka bir resim çekmek ve sonradan saymak. Larva duvarlara tarama veya agar içine burrowing gibi, belirsiz ışık tercih gösteren larva nötr tercih olarak kabul edilmelidir ve sadece ışık tercih endeksi hesaplanır larvaların toplam sayısı dahil.
8. Sayma sonra, larva ile plaka atmak ve bir sonraki deneme için yeni bir test plakası ile değiştirin. Daha sonra kullanım ve bertaraf için bir otoklav plastik torba kullanılan levhaları toplamak.
9. Yeni bir genotip test edilebilir deneyler yeterli sayıda gerçekleştirdik. Genotip başına 10-15 çalışmalarda analiz için yeterlidir.

5. Veri analysis

1. Kolaylık sağlamak için Excel (Microsoft) veya daha ileri istatistiksel analiz için bir bilgisayarda Kökeni (Origin Lab) gibi bir veri sayfasına veri aktarımı. Bir sütunda bir ikinci kolon üzerinde ışık kadranda hayvan sayısı ve plaka ("nötr" larvaları dahil) toplam hayvan üçüncü karanlıkta hayvan sayısı, düzenleyin.
2. Aşağıdaki formül kullanılarak her bir deney için karanlık için tercih indeksi (PREF) hesaplayın:
   PREF (karanlık) = (karanlıkta larva sayısı - larva sayısı ışığında) / larva sayısı
3. Gruplar için uygun bir analiz ile istatistiksel veri kümesi karşılaştır. Burada, istatistiksel olarak iki grup karşılaştırmak için Wilcoxon testi kullanın. Bir Tukey çoklu karşılaştırma ile bir ANOVA testi post hoc normal dağılım varsayımı bir manifoldu grup karşılaştırıldığında yerine ise testi, yapılabilir.
4. Günün döngüsü boyunca çizgiler ve zaman noktaları arasında açık karşılaştırmalar göstermektedir grafikler olun. WE kullanımı Origin Yazılım (Origin Lab) istatistiksel olarak anlamlı test etmek ve uygun grafikler oluşturmak, ama başka bir istatistik programı yararlı olabilir için.

Sonuçlar

Protokol yukarıda açıklanan ardından, vahşi tip Canton-S erken üçüncü larva stadyumda ışık-karanlık tercih iki farklı sirkadiyen kez CT0 ve CT12 de uçar test. Yetişkin 12-saat ışık-12-saat karanlık yetiştirilen ve 12 saat için yumurtalarını bırakmak kalmıştı. Larva aynı ışık-karanlık rejimi altında ilk iki gün büyür. Biz sabit koşullar (sirkadiyen saat çalışan ücretsiz) altında sirkadiyen modülasyon test etmek istedim çünkü testi (Şekil 3A) yapıldı kadar...

Tartışmalar

Açıklanan ışık tercih testi larva doğuştan photobehavior yararlanır. Tahlil, kurmak kolay düşük maliyetle çok tekrar izin verir ve ışık algılama ve işleme hakkında değerli bilgiler sunar. Deneysel paradigma bireyler açık veya koyu tercih kaç nispeten hızlı ölçümü sağlar. Bu tercih ham yüzde olarak veya alternatif olarak tercih Endeksi (PREF) olarak görüntülenebilir. PREF hayvanların fark olarak ifade edilir tercih karanlık hayvanların toplam bölünmesiyle, bu tercih edilen hafif ve b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	A5093-500G	2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland
Petri dishes	Greiner Bio-One GmbH	633180	90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria
LEDs Lamp	OSARAM	80012 White	LED lamp, 80012 White
Environment Meter	PCE	PCE EM882	Lux, Temp, RH%
Thermostatic cabinet	Aqua Lytic (Liebherr)	ET636-6
Light timer	Timer T	6185.104	230V/50HZ (check specifications for your country)
Universal thermostat	Conrad	UT200
Humidifier	Boneco
Balck tape	Tesa		5 cm
Glue	Uhu
lncubator lamp	Phillips	Softtone	5W
Timer clock	Ziliss		Ziliss, Switzerland
Excel Software	Microsoft		Excel
Origin Software 8.5	OriginLab
Backer Yeast	Migros Switzerland
Iron support stand 17X28CM	Fisher Scientific	S47808
Acetic acid	Sigma Aldrich	A6283-100ML	20% acetic acid dilluted in H2O
Red light lamp	Phillips	PFE712E*8C
Spatula	Fisher Scientific	14-373-25A
Power supply	EA	EA PS 2042-06B	Optional
Aluminium foil	Prix Coop
Heater	GOON	NSB200C
Microwave Oven	Intertronic
Standard corn meal fly food
Destilled water