Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Summary

כאן אנו מתארים מבחן העדפת אור בחושך לזחל דרוזופילה. assay זה מספק מידע על רגולציה מולדת ויממה של photobehavior חישה ועיבוד אור.

Abstract

מעשי אור כאות סביבתית לשלוט בהתנהגות בעלי חיים ברמות שונות. מערכת העצבים תסיסנית הזחל משמשת כמודל ייחודי כדי לענות על שאלות בסיסיות על האופן בו מידע מעובד ואור משותף בין התנהגויות מהירות ויממה. זחלים תסיסנית להציג התנהגות הימנעות סטריאוטיפית בעת חשיפה לאור. כדי לחקור התנהגויות האור תלויות יכולות להיות מיושמות בדיקות בכורה אור כהות comparably פשוטות. בבעלי חוליות ופרוקי רגלי המסלולים העצביים המעורבים בחישה ועיבוד תשומות חזותיות חופפים באופן חלקי עם מידע היממה photic אלה עיבוד. השאלה המרתקת של איך מערכת חישת האור ומערכת היממה אינטראקציה כדי לשמור על תפוקות התנהגות מתואמות נשארה במידה רבה שלא נחקר. דרוזופילה היא מודל משפיע ביולוגי לגשת לשאלות אלה, בשל מספר קטן של תאי עצב במוח ובזמינות של כלים גנטיים לmanipul העצביation. Assay העדפת אור האפל הציג מאפשר החקירה של מגוון רחב של התנהגויות חזותיות כולל בקרה ביולוגי של Phototaxis.

Introduction

כאן אנו מתארים assay התנהגותית המבוסס על העדפת הזחל לכהה (או בהיר). זחלים להגיב עם תגובת photonegative חזקה וסטריאוטיפית בשלבי ליקוט (L1 לתחילת L3) ^1. Assay נועד להעריך את התנהגות photophobic של הזחל ומשווה את ההעדפה בהירה או כהה של קבוצה של זחלים לנוע בחופשיות בצלחת פטרי מצופה באגר. assay התנהגותי זה מספק מידע על רגישות, אינטגרציה וזמן הפלסטיות של מערכת הראייה לא רק, זה עוד יותר מספק רמזים על איך רגישות לאור והתהליך שלה נשלט על ידי מערכת היממה.

עין הזחל דרוזופילה (Bowlig איברים מכונים גם: BO), היא האיבר העיקרי לתפיסת אור. כל עין מורכבת מקולטנית אור 12 (PR), שמונה הפורטוריקנים להביע rhodopsin6 הירוק רגיש (RH6) וארבעה הפורטוריקנים להביע rhodopsin5 הכחול הרגישים (rh5) ^2,3. בנוסף לPRS, alsנוירונים o Class IV multidendritic, אשר מכסים את קיר גוף הזחל, זוהו להגיב לעוצמות אור רעילים ^4,5. כמו כן, ידוע כי נוירונים קוצבים לב הנמצאים במוח הזחל המרכזי להביע רגיש חלבון Cryptochrome האור (Cry) שפועל כחיישן אור כחול שעון פנימי בתוך המוח ^6,7. מסקרן photophobicity של בעלי חיים מסוג בר מציג מרכיב ביולוגי בנקודות זמן שונות במהלך היום ובלילה בעת בדיקה עם assay זה. תגובות לאור של זחל L3 ליקוט הראו photophobicity החזק עם שחר וphotophobicity נמוך יותר בשעה בין הערביים, כאשר נבדקו על העדפת אור בחושך ^7. מעניין רק Rh5-הפורטוריקנים נדרשים להימנעות אור, ואילו RH6-הפורטוריקנים הם מיותר. שניהם, Rh5-הפורטוריקנים וRH6-הפורטוריקנים מעורבים באיפוס השעון המולקולרי על ידי אור ^8. מסלול Cry חייב להיות מתואם עם מסלולי אור חישה-האחרים לתזמר פלט התנהגותי מתאים בבמהלך היום. אצטילכולין בהפורטוריקנים ממלא תפקיד חיוני בהתנהגות הימנעות אור, כמו גם מחדירה של השעון המולקולרי. חסימה עצבית אצטילכולין מהפורטוריקנים לנוירונים קוצב היממה מפחיתה את תגובת photophobic בassay העדפת אור החושך ^8. העסקתו assay, שני זוגות סימטריים של נוירונים שזוהו לאחרונה כדי לעבור את העדפת האור של הזחל instar השלישי של דרוזופילה ^9. שני זוגות אלו של נוירונים ניתן לתפקד בשלבי זחל מאוחרים, כאשר בעלי חיים להשאיר את האוכל למצוא אתר מתאים pupariation ככל הנראה. עם זאת, השאלה של איך את מסלולי ויזואליים אינטראקציה ולשלוט בהתנהגות חזותית הזחל באופן היממה נותרה במידה רבה ללא מענה. Assay העדפת האור מאפשר השוואות בין נקודות זמן היממה, לטוס קווים ומדינת היממה תחת איכויות אור שונות. Assay הוא קלות מוכן ולא יקר וכבר שימושי בעבר אניn כמה מעבדות לתאר וללמוד את ההתנהגות נגזרת אור בזחל.

Protocol

1. גידול הזחל

1. שמור לטוס זנים או צלבים גנטיים בתרבות המונים של 25 מעלות צלזיוס במדיום קמח תירס תחת אור של 12 שעות מחזור של 12 שעות חשכה בזבוב חממה מצויד באור ושעון עצר.
2. לדלל שמרי תומכת במים ליצירת עיסה נוזלית (10 גרם של שמרי תומך מדוללים עם 3-4 מ"ל מזוקק H ₂ O). הוסף טיפה קטנה למזון קמח התירס ולכסות את הבקבוקונים. בואו יבש לשעה אחת לפחות, כדי למנוע זבובים בוגרים דבק דבק השמרים. לשים טיפה קטנה של שמרים מדוללים במים על פני השטח של המזון יכול לשפר את ההטלה. לחלופין, ניתן להשתמש בייקר שמרים להדביק, 20% חומצה אצטית (AcOH) (סיגמה אולדריץ, שוויץ A6283-100 מ"ל). לשם כך, טובל את הקצה של Q-טיפ על הפתרון והמרווח על פני שטח מזון קמח התירס.
3. שים זבובים בוגרים (לפחות ארבעה ימים, אך לא יותר מעשרה ימים) בבקבוקוני מזון קמח תירס. שים מספיק מבוגרים לכל בקבוקון על מנת לקבל זחלים מספיק כדי לחזור על ההעדפהלבדוק כמה פעמים ולאפשר השוואה סטטיסטית. לצלבים גנטיים, אנו משתמשים בדרך כלל למינימום של 20 נקבות וזכרים 5-10 לכל בקבוקון, אבל כמה קווים דורשים יותר נקבות כדי להשיג צאצאי הזחל מספיק.
4. אפשר למבוגרים להטיל ביצים ל12 שעות ולהעבירם לבקבוקונים חדשים. ניתן להעביר מבוגרים בבוקר ובערב. אנחנו בדרך כלל להעביר את המבוגרים במשך שבעה עד עשרה ימים, ואם נדרשו לקחת מבוגרים חדשים.
5. שמור את אוספי הביצים שנלקחו בכל שעה 12 בחממה ולתת לגדול זחלים של 25 מעלות צלזיוס, חושך מחזור של 12 שעות אור 12 שעות ו 60% לחות. לבדיקת רכיבי היממה של זחלים חזותיים התנהגות מעבר לחשכה מתמדת (DD) 48 שעות לאחר איסוף ביצים (מקביל לשני מחזורי האור כהים). לשם כך, השתמש בחממה נפרדת בלי אור אבל לשמור על כל תנאים אחרים, כגון טמפרטורה ולחות זהה. הקפד להעביר את הבקבוקונים לחממת DD ממש לפני המעבר לשלב הכהה. לפני שעבר את הבקבוקונים לanothאה חממה לשים בקבוקונים בקופסא קרטון או לעטוף את הבקבוקונים עם רדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור במהלך ההעברה (אריזה בקופסא קרטון או עטיפה שצריך לעשות בזמן "כיבוי האורות בשלב" לפני המשמרת בין חממות). למנוע את בעלי חיים מכל חשיפה לאור לאחר נקודה זו ועד תחילת ניסויים.
6. לאחר 4 ימים (84-108 שעות מהטלה) לאסוף מוקדם L3 (זחלי האכלה) בנקודות הזמן שנבדקה (ראה 4. אור העדפת בדיקה, נקודה. 4.4.).

2. התקנת מבחן

1. לבצע ניסויים בחדר חשוך עם טמפרטורה קבועה ותנאי לחות.
2. כדי לשמור על שני רביעים של צלחת פטרי בחושך, לכסות את המכסה עם סרט שחור ורדיד אלומיניום. כדי לעשות זאת, סמן את מרכז היקף המכסה. גם לסמן ארבע נקודות בגבול של המכסה עם 90 מעלות של הפרדה ביניהם. כדי לעשות את זה קל יותר, לצייר ריבוע 20 ס"מ מחולק לארבעה רבעים באורך 10 ס"מ עלגיליון נייר או בעזרתו של מחשב. לחתוך 10 ס"מ ריבועים של נייר אלומיניום וסרט שחור (איור 1 א). לכסות שני רביעים ההפך על ידי הדבקה של רדיד אלומיניום רבוע, כשכבה ראשונה וסרט שחור מכסה אותו, יש להיזהר גם כדי לכסות את הגבול של המכסה.
   בעבר שתי צורות מעט שונות של מבחני זה היו בשימוש. אנחנו כאן שימוש assay "רבע הצלחת", שבו צלחת פטרי מחולקת לארבעה רבעים שווים ^10. ב assay האלטרנטיבי "חצי הצלחת" צלחת פטרי מחולקת חצי (חצי נחשף לאור, בחשכה) ^1,7,8. עד היום לא נמצא הבדלים משמעותיים בין שני מבחני כבר פורסם.
3. דבק גיליון רבע כגון זה המשמש לסימון את המכסים ממש מתחת למקור האור על השולחן. סמן היקף של צלחת פטרי התרכזה בצומת הרביעים. השתמש בסימנים כהתייחסות למקום את צלחת המבחן תמיד באותה התנוחה מתחת למקור האור.
4. התקןמנורה, או הנורה פשוט אור לבן (פיליפס, Softtone 5W) או מנורת LED (מנורת LED, 80012 הלבנה, Osram) מעל צלחת פטרי עם העזרה של דוכן תמיכת ברזל (פישר סיינטיפיק, S47808). התאם את הגובה באופן שכל מבחן הצלחת מוארת homogenously. אנו ממליצים בחום על השימוש בנורות LED שכן הם פולטים אורכי גל מסוימים יותר מנורות רגילות. יתר על כן נוריות פולטות פחות חום.
5. התאם את עוצמת אור בעזרת פוטומטר (סביבת מד PCE EM882). כדי להשיג את עוצמת האור הנדרשת של 350-760 לוקס, להזיז את המנורה כלפי מעלה או מטה בהתאם לצורך. חיבור המנורה לאספקת חשמל מתכווננת נותן יותר גמישות לשנות את העוצמות מבלי להזיז את המנורה (איור 1).

3. הכנת צלחות

1. לעשות 200 מ"ל של 2.5% אגר (סיגמא אולדריץ, שוויץ A5093-500G) עם מים מזוקקים פעמיים (Millipore).
2. הנח צלחות פטרי על שולחן (90 מ"מ קוטר;גריינר ביו אחד GmbH, 4550 Kremsmeinster, אוסטריה) בשורות כדי לאפשר לשפוך חם agarose.
3. מרתיחים את agarose במיקרוגל עד שהפתרון הוא שקוף לחלוטין ונוזלים. ודא שתמיסה נוזלית אינו מכילה בועות. זהירות: תחבורה בזהירות לשולחן מאז הפתרון יכול להיות חם מאוד!
4. יוצקים חם agarose לתוך צלחות פטרי עד שכל המשטח מכוסה homogenously עם שכבה דקה של הפתרון, על שתיים או שלושה מילימטרים הם מספיק. להיות מהיר כדי למנוע agarose חיזוק לפני הציפוי את כל הצלחות. בואו הצלחות להתקרר. אחסן את הצלחות בטמפרטורת חדר ולהשתמש בם רק באותו היום של הכנה.

4. מבחן זיקה לאור

1. לעבוד בתנאי אור אדומים בחדר הניסוי כדי למנוע השפעת האור לפני המבחן מאז תסיסנית אינו מסוגל לחוש אורכי גל של אור אדום. השתמש בנורה אדומה (פיליפס, PFE712E * 8) עלתה במנורה כדי להאיר לאהוא מקום העבודה.
2. לשמור על טמפרטורה בכל הניסויים של 25 ° C. טמפרטורת חדר בקרה באמצעות מכשיר חימום או קירור במידת צורך.
3. קח קצת אוכל מהבקבוקונים שגדלו לשני מחזורי יום תחת חשכה מתמדת (מסעיף 1). מאז זחלים בדרך כלל חופרים על פני השטח של המזון, לקחת את השכבה העליונה (כ -5 מ"מ עמוק) עם עזרה של מרית (פישר סיינטיפיק, 14-373-25A). מורחים את האוכל בצד החיצוני של המכסה צלחת פטרי, להוסיף קצת מים ומערבבים בעדינות בעזרת המרית.
4. לאסוף האכלת זחלי L3 ממזון. כהעדפת אור תיבחן, בחירה רק בתחילת / האכלת זחלי L3 הוא קריטי מאז Phototaxis השלילי מובטח. מאוחר / נדודי זחלי L3 או זחל גדול זוחלים על האוכל כנראה כבר עבר photobehavior שלהם. יכולים להיות מוכרים זחלי L3 האכלה (phototactic השלילי) כי spiracles הקדמי שלהם הם פתוח ובלט החוצה בצורה דמוית אצבע. Spiracle האחורייש שלושה פתחים של כל אחד, וארבע קבוצות של שערות מסועפות גדולות. בלוטות הרוק להאריך למגזר השני ¹¹ הבטן. Staging זחל תחת מיקרוסקופ הוא נוח ואילו אמור לשמש לא אור לבן. מנורת אור אדומה היא הכרחית כדי להאיר את הזחלים אם זמני תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי לפני נדרשים ניסויים.
5. שטוף זחלים בקצרה במים ברז ולאסוף זחלים שלישי instar-האכלה המוקדמת (עדיין באור אדום). לפני העברת הזחלים לצלחת הבדיקה, לקחת את הזחלים עם מכחול רטוב ולספוג עודפי מים בזהירות במגבת נייר או נייר סינון. לא לייבש יתר על המידה זחלים מדי שכן הוא עלול לפגוע בבעלי החיים ולהשפיע על התנהגותו.
6. באמצעות המכחול הרטוב להעביר את הזחלים בזהירות לצלחות. הנח קבוצה של כ 30 זחלים במרכז הצלחת. מכסה את הצלחת עם המכסה כבר מוכן עם הרבעים והניח את הצלחת מתחת למקור האור מוכן לניסוי (ראה שניותtion 2).
7. הדלק את מנורת האור הלבנה ולהתחיל את הטיימר. תן את הזחל לנוע בחופשיות על הצלחת למשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר במהירות את המכסה ולספור את מספר הזחלים בחושך ובאור הרביעים. סימון המיקום של כל זחל עם סמן יכול להקל על הספירה. לחלופין לקחת תמונה של הצלחת ולספור בדיעבד. זחלים מראים העדפה ברורה אור, כמו זחלים זוחלים על הקירות או מתחפרים לתוך אגר צריכים להיחשב כהעדפה ניטראלית ופשוט להיכלל במספר הכולל של זחלים כאשר מדד העדפת האור מחושב.
8. לאחר הספירה, לבטל את הצלחת עם זחלים ולהחליף עם צלחת בדיקה חדשה לניסוי הבא. לאסוף צלחות בשימוש בשקית פלסטיק חיטוי לטיפול וסילוק מאוחר יותר.
9. לאחר שבצעת מספר מספיק של ניסויים ניתן נבדקו גנוטיפ חדש. 10-15 ניסויים לגנוטיפ מספיקים לניתוח.

5. ניתוח נתוניםשל

1. לנוחיותך להעביר את הנתונים לגיליון נתונים כמו אקסל (Microsoft) או מקור (מעבדה מקור) במחשב לניתוח סטטיסטי נוסף. סדר בעמודה אחת את מספר בעלי החיים בחשכה, בעמודה שנייה את מספר בעלי החיים ברביעי אור ובשלישי הכולל של בעלי חיים בצלחת (כולל זחלים "ניטראלי").
2. לחשב את מדד ההעדפה (PREF) לחושך עבור כל ניסוי תוך שימוש בנוסחה הבאה:
   PREF (חושך) = (כמות זחלים בחושך - מספר הזחלים באור) / מספר כולל של זחלים
3. להשוות סטטיסטי קבוצה של נתונים עם ניתוח מתאים לקבוצות. כאן, אנו משתמשים במבחן Wilcoxon להשוות סטטיסטי בין שתי קבוצות. מבחן ANOVA מרובה עם ההשוואה של טיוקי בדיעבד ניתן לעשות בדיקה, אם הנחת התפלגות נורמלית מתקיימת בהשוואת קבוצת סעפת.
4. הפוך את הגרפים שמראים באופן ברור השוואות בין קווים ונקודות זמן לאורך מחזור היום. Wתוכנת מקור שימוש בדואר (מעבדת מקור) כדי לבדוק את המובהקות סטטיסטיות וליצור גרפים מתאימים, אבל בכל תוכנה סטטיסטית אחרת יכולה להיות מועילה.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל, בדקנו העדפת אור בחושך באצטדיון הזחל שלישי המוקדם של סוג בר קנטון-S טסה בשתי פעמים Ct0 וCT12 שונות היממה. מבוגרים גודלו 12 שעות אור 12 שעות חושך והשאירו להטיל ביצים עבור 12 שעות. זחלים לגדול ביומיים הראשונים תחת אותו משטר אור בחושך. מכיוון שאנו רוצ...

Discussion

בדיקת העדפת האור תאר מנצלת photobehavior מולדת הזחל. Assay קל להקים, מאפשר חזרות רבות בעלות נמוכה ומספק מידע רב ערך על חישת אור ועיבוד. פרדיגמה הניסויית מאפשרת כימות מהירה יחסית של כמה אנשים מעדיפים אור או חושך. העדפה כזו יכולה להיות מוצגת כאחוזים גולמיים או לחלופין כמדד העדפו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	A5093-500G	2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland
Petri dishes	Greiner Bio-One GmbH	633180	90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria
LEDs Lamp	OSARAM	80012 White	LED lamp, 80012 White
Environment Meter	PCE	PCE EM882	Lux, Temp, RH%
Thermostatic cabinet	Aqua Lytic (Liebherr)	ET636-6
Light timer	Timer T	6185.104	230V/50HZ (check specifications for your country)
Universal thermostat	Conrad	UT200
Humidifier	Boneco
Balck tape	Tesa		5 cm
Glue	Uhu
lncubator lamp	Phillips	Softtone	5W
Timer clock	Ziliss		Ziliss, Switzerland
Excel Software	Microsoft		Excel
Origin Software 8.5	OriginLab
Backer Yeast	Migros Switzerland
Iron support stand 17X28CM	Fisher Scientific	S47808
Acetic acid	Sigma Aldrich	A6283-100ML	20% acetic acid dilluted in H2O
Red light lamp	Phillips	PFE712E*8C
Spatula	Fisher Scientific	14-373-25A
Power supply	EA	EA PS 2042-06B	Optional
Aluminium foil	Prix Coop
Heater	GOON	NSB200C
Microwave Oven	Intertronic
Standard corn meal fly food
Destilled water