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요약

여기에 우리가 초파리 유충에 대한 빛 어두운 환경 테스트를 설명합니다. 이 분석은 빛을 감지하고 처리 photobehavior의 타고난 및주기 조절에 대한 정보를 제공합니다.

초록

다양한 수준에서 동물의 행동을 제어하는​​ 환경 신호로 빛의 역할을합니다. 초파리 애벌레 신경계 빛 정보를 처리하고 신속하고주기 행동 사이에 공유하는 방법에 대한 기본적인 질문에 대답 할 수있는 독특한 모델로 사용됩니다. 빛에 노출되면 초파리의 애벌레가 박힌 회피 동작을 표시합니다. 비교적 간단한 빛 어두운 환경 시험을 적용 할 수있는 빛에 따라 행동을 조사합니다. 척추 동물과 절지 동물의 시각적 입력을 감지하고 처리에 관련된 신경 경로는 부분적으로 그 처리 빛의 생체 정보와 중복. 빛 감지 시스템과 생체 시스템이 행동 출력을 조정 유지하기 위해 상호 작용하는 방법의 매혹적인 질문은 대부분 미개척 남아있다. 초파리는 뇌의 신경 세포의 작은 숫자로 인해 이러한 문제에 접근하는 영향을 미치는 생물학적 모델, 유전 도구의 가용성이다 신경 속임수 장난감을위한ATION. 제시 빛 어두운 환경 분석은 phototaxis에의주기 제어를 포함한 시각적 인 행동의 범위를 조사 할 수 있습니다.

서문

여기에서 우리는 어둠의 애벌레 선호 (또는 빛)에 따라 행동 분석을 설명합니다. 애벌레는 먹이를 찾아 다니는 단계 (초기 L3에 L1) 1시 강력하고 진부한 photonegative 응답과 반응. 분석은 유충의 photophobic 행동을 평가하는 목적과 애벌레 한천로 코팅 된 배양 접시에서 자유롭게 이동 그룹의 밝거나 어두운 환경을 비교합니다. 이 행동 분석의 시각 시스템의 감도, 통합과 시간 소성에 대한 정보를 제공뿐만 아니라, 그것은 더 빛 감도와 해당 프로세스가주기 체계에 의해 통제하는 방법에 대한 힌트를 제공합니다.

초파리 유충의 눈 (또한 불리는 Bowlig 기관, BO), 광각의 주요 기관이다. 각각의 눈은 12 광 수용체 (PR)로 구성되어, 여덟 푸에르 토리코는 푸에르 토리코는 파란색에 민감한 rhodopsin5 (RH5) 2,3을 표현 녹색 민감한 rhodopsin6 (RH6)와 네 표현한다. 푸에르 토리코, ALS에 추가애벌레 몸을 벽을 커버 O 클래스 IV의 multidendritic 뉴런은, 유해 빛의 강도 4,5에 응답하는 확인되었습니다. 또한 중앙 유충의 두뇌에 자리 잡고 맥박 조정기 뉴런은 뇌 6,7에서 시계 고유의 푸른 빛을 센서로 작동 빛에 민감한 단백질 Cryptochrome (울어)을 표현하는 것으로 알려져있다. 이 분석으로 테스트 할 때 흥미롭게 야생 유형 동물의 photophobicity 낮과 밤의 과정에서 서로 다른 시간 지점에서주기 구성 요소를 보여줍니다. 빛 어두운 환경 7을 테스트 할 때 꼴 L3 유충의 빛에 반응 황혼에서 새벽에 강한 photophobicity 낮은 photophobicity을 보여 주었다. RH6 - 푸에르 토리코가 없어도있는 동안 흥미롭게 만 RH5-푸에르 토리코는, 빛을 피하기 위해 필요합니다. , RH5-푸에르 토리코 및 RH6 - 푸에르 토리코 모두 빛을 8로 분자 시계를 재설정에 참여하고 있습니다. 외침 경로는에 적절한 행동 출력을 조율하는 다른 빛 감지 경로로 조정해야오늘의 코스입니다. 푸에르 토리코에있는 아세틸 콜린 라이트 회피 행동뿐만 아니라 분자 시계의 유입에 필수적인 역할을한다. 푸에르 토리코에서주기 맥박 조정기 뉴런에 아세틸 콜린 신경 전달 물질을 차단하면 빛 어둠 환경 분석 8 photophobic 반응을 감소시킨다. 동일한 분석을 고용 뉴런의 두 개의 대칭 쌍은 최근 초파리의 9 번째 애벌레 령의 빛 환경을 전환 확인되었습니다. 동물이 아마도 적절한 pupariation 사이트를 찾기 위해 음식을 떠날 때 뉴런의 두 쌍 늦은 애벌레 단계에서 작동 할 수 있습니다. 그러나 시각 경로의 상호 작용과 생체 방식으로 애벌레 시각적 동작을 제어하는​​ 방법의 문제는 크게되지 않은 상태로 유지됩니다. 빛 환경 분석은주기 시간 지점 사이 비교, 다른 가벼운 특성에 따라 라인과주기 상태를 비행 할 수 있습니다. 분석은 쉽게 준비하고 저렴하고 내가 이전에 유용했습니다N 여러 실험실 설명하고 유충에서 빛 파생 된 행동을 연구한다.

프로토콜

1. 유생 양육

  1. ° C 옥수수 식사 중간에 빛과 타이머가 장착 된 비행 배양기에서 12 시간 빛 - 12 시간 어두운주기에서 25 대중 문화에 변형 또는 유전자 교차 비행을 유지한다.
  2. 유체 붙여 넣기 (H 2 O를 증류 3-4 ml의 희석 후원자 효모 10g)를 형성하는 물에 후원자 효모를 희석. 옥수수 식사 음식에 작은 방울을 추가하고 튜브를 포함한다. 효모 붙여 넣기를 고집 성인 파리를 방지하기 위해 한 시간 이상 건조시킵니다. 음식의 표면에 물에 희석 효모의 작은 방울을 넣으면 산란을 향상시킬 수 있습니다. 또는 빵 효모 붙여 넣기, 20 % 아세트산 (AcOH) (시그마 알드리치, 스위스 A6283-100ML)를 사용할 수 있습니다. 이를 위해 옥수수 식사 음식 표면에 용액 확산에 Q - 팁의 끝을 담근다.
  3. 옥수수 식사 음식 유리 병에 (이상 10 일 이내 4 일 이상 오래된, 그러나) 성인 파리를 넣습니다. 기본 설정을 반복하기에 충분한 애벌레를 얻기 위해 각각의 병에 충분한 어른을 넣어여러 번 테스트 및 통계 비교를 할 수 있습니다. 유전 십자가를 위해, 우리는 일반적으로 20 여성과 유리 병 5 ~ 10 남성의 최소를 사용하지만, 일부 라인은 충분한 애벌레 자식을 얻기 위해 더 많은 여성을 필요로합니다.
  4. 12 시간 동안 알을 낳기 새로운 튜브로 전송할 성인을 허용합니다. 성인은 아침과 저녁에 전송할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 7-10일 어른​​를 전송하고 필요한 경우 새 성인을.
  5. 인큐베이터에있는 모든 12 시간을 촬영 계란 컬렉션을 유지하고 25 유생 ° C, 12 시간 빛을 12 시간 어두운주기와 60 %의 습도를 증가 할 수 있습니다. 달걀 수집 한 후 일정한 어둠 시각적 동작 이동 유충 (DD) 48 시간 (두 개의 빛 어두운주기에 해당)의 생체 구성 요소를 테스트합니다. 이 경우, 빛이없는 별도의 인큐베이터를 사용하지만 같은 온도와 동일한 습도 다른 모든 조건을 유지합니다. 단지 어두운 단계로 전환하기 전에 DD 인큐베이터에 튜브를 전송해야합니다. anoth하기 위해 튜브를 이동하기 전에어 인큐베이터 골판지 상자에 튜브를 넣어하거나 전송하는 동안 빛의 노출 (판지 상자 또는 포장에 포장이 부화기 사이의 이동에 앞서 "등 -에 대한 단계"중에 수행 할 수있다)를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 래핑합니다. 이 시점 이후 및 실험 개시 될 때까지 빛의 노출에서 동물을 방지합니다.
  6. 사일 후 (누워 계란 84-108 시간) (4를 참조하십시오. 빛 환경 테스트를 가리 킵니다. 4.4.) 테스트 할 시점에 이른 L3 (먹이 유충)를 수집합니다.

2. 테스트 설정

  1. 일정한 온도와 습도 조건에 어두운 방에서 실험을 수행 할 수 있습니다.
  2. 어둠 속에서 페트리 접시의 두 사분면을 유지하기 위해, 검은 테이프와 알루미늄 호일로 뚜껑을 포함한다. 이렇게하려면, 뚜껑 둘레의 중심을 표시합니다. 또한 그들 사이의 분리 90 °와 뚜껑의 가장자리에 네 개의 점을 표시합니다. 쉽게 만들려면 약 10 cm 길이의 네 개의 사분면으로 나누어 20 센티미터 정사각형을 그립니다종이 또는 컴퓨터의 도움으로 시트. 알루미늄 호일과 검은 색 테이프 (그림 1A)의 10cm의 사각형을 잘라. 그것을 다루는 첫 번째 층과 검은 테이프와 같은 알루미늄 호일의 제곱 접착에 의해 두 개의 반대 사분면을 커버 또한 뚜껑의 테두리를 충당하기 위해주의해야합니다.
    과거에 분석의 두 가지 다소 독특한 형태를 사용 하였다. 우리는 여기에서 페트리 접시를 10 개의 동등한 분기에 분할되어있는 "분기 플레이트"분석을 사용합니다. 다른 "반 판"분석에 페트리 접시가 구분되어 반 (반 빛, 어둠 속에서 절반에 노출) 1,7,8. 지금까지 두 분석간에 유의 한 차이가 게시되지 않았습니다.
  3. 접착제 그러한 권리 테이블에 광원에서 뚜껑을 표시하는 데 사용되는 하나 사분면 시트. 사분면의 교차점을 중심으로 페트리 접시의 둘레를 표시합니다. 참조가 광원에서 동일한 위치에 항상 테스트 판을 배치하기로 마크를 사용합니다.
  4. 를 설치램프, 하나 간단한 흰색 전구 (필립스, Softtone 5W) 또는 철 지지대 (피셔 과학, S47808)의 도움으로 페트리 접시 위에 LED 램프 (LED 램프, 80012 화이트 오스람). 전체 테스트 플레이트가 균일하게 조명되는 방식으로 높이를 조정합니다. 그들은 종래의 전구보다 특정 파장을 방출 때문에 우리는 강력 LED 램프의 사용을 권장합니다. 또한 LED는 적은 열을 방출한다.
  5. 광도계 (환경 미터 PCE EM882)의 도움으로 빛의 강도를 조정합니다. 필요에 따라 350-760 룩스의 필요한 빛의 강도를 달성하기 위해 최대 램프를 아래로 이동. 조정 전원 공급 장치에 램프를 연결하면 램프 (그림 1B)를 이동하지 않고 강도를 변경할 수 있도록 더 많은 유연성을 제공합니다.

3. 플레이트 준비

  1. 증류수 (밀리 포아)에 2.5 % 한천의 200 ML (시그마 - 알드리치, 스위스 A5093-500G)를 확인합니다.
  2. 테이블 (90 mm 직경의 배양 접시를 놓습니다;GREINER 바이오 - 하나 GmbH는 행 4550 Kremsmeinster, 오스트리아) 뜨거운 아가로 오스 쏟아져 허용합니다.
  3. 이 솔루션은 완전히 투명하고 액체가 될 때까지 전자 레인지에 아가로 오스 끓인다. 액체 용액이 거품이 포함되어 있지 않은지 확인하십시오. 주의 : 조심스럽게 테이블에 전송 솔루션은 매우 뜨거울 수 있기 때문에!
  4. 전체 표면이 균일 용액의 얇은 층으로 덮여 때까지 배양 접시에 뜨거운 아가을 부어 약 2 개 또는 세 밀리미터 충분합니다. 코팅, 번호판을하기 전에 응고 아가을 방지하기 위해 신속합니다. 접시를 냉각 할 수 있습니다. 상온에서 번호판을 저장 만 준비 같은 날에 그들을 사용합니다.

4. 빛 성향 테스트

  1. 초파리 이후 테스트 빛의 붉은 파장을 감지 할 수 없습니다 전에 빛의 영향을 방지하기 위해 실험 실에서 붉은 빛 조건에서 작동합니다. t를 조명하는 램프에 장착 된 빨간 전구 (필립스, PFE712E * 8)를 사용하여그는 작업을 배치합니다.
  2. 25 모든 실험을 통해 온도를 유지 ° C. 히터 나 냉각 장치를 통해 제어 실내 온도가 필요합니다.
  3. 일정한 어둠 미만 일주기 (섹션 1)에 대한 사육 병에서 어떤 음식을 가져 가라. 유충은 일반적으로 음식의 표면에 파고되기 때문에, 주걱 (피셔 과학, 14-373-25A)의 도움으로 최상위 계층 (약 5 mm 깊이) 가라. 페트리 접시 뚜껑의 바깥면에 음식을 확산, 약간의 물을 추가하고 주걱으로 가볍게 섞는다.
  4. 음식에서 L3 유충을 먹이 수집합니다. 빛 환경을 테스트 할 때, 부정적인 phototaxis에이 보장되기 때문에 단지 L3 유충을 먹이 / 조기 중요합니다 선택. 방황 / 후반 음식에 크롤 링 L3 유충이나 큰 애벌레는 아마 이미 photobehavior 투입합니다. 자신의 앞쪽에 spiracles이 열려 있고 손가락 같은 형태로 외부로 돌출하기 때문에 먹이 L3 유충 (음수 phototactic)를 인식 할 수 있습니다. 후방 공기 구멍의 세 구멍 각, 대형 분기 머리카락의 4 개의 그룹이 있습니다. 침샘 두 번째 복부 세그먼트 (11)에 확장 할 수 있습니다. 더 하얀 빛을 사용하지 않아야 반면 현미경으로 애벌레를 준비하면 편리합니다. 붉은 빛 램프 실험이 요구되기 전에 입체 현미경으로 준비하면 유충을 분명히 할 필요가있다.
  5. 수돗물에 잠시 유충을 세척하고 초기 먹이 세 번째 instar의 유충을 (여전히 붉은 빛)를 수집. 테스트 플레이트에 유충을 전송하기 전에, 젖은 붓으로 유충을 가지고 종이 타월이나 여과지로 물기를 잘 흡수. 그것은 동물을 해칠 및 그 동작에 영향을 미칠 수 있기 때문에 너무 과도 애벌레를 건조하지 마십시오.
  6. 젖은 붓을 사용하여 조심스럽게 접시에 애벌레를 전송합니다. 접시의 중앙에 약 30 유충의 그룹을 배치합니다. 뚜껑을 이미 사분면을 준비와 함께 접시를 덮고 (초를 참조하십시오 실험 준비 광원에서 접시를 설정TION 2).
  7. 하얀 빛 램프를 켜고 타이머를 시작합니다. 유충은 5 분 접시에 자유롭게 이동하자 재빨리 뚜껑을 제거하고 어둠과 빛의 사분면에있는 유충의 수를 계산합니다. 마커로 각 유충의 위치를​​ 표시하면 계산을 쉽게 할 수 있습니다. 또는 판의 사진을 촬영하고 사후를 계산합니다. 애벌레가 벽에 크롤 링이나 한천로 굴처럼 불분명 빛 환경 설정을 보여 유충은 중립적 환경으로 간주되어야하며, 단지 빛 환경 지수를 계산 유충의 총 수에 포함.
  8. 계산 후, 유충과 함께 접시를 무시하고 다음 실험을위한 새로운 테스트 플레이트로 교체합니다. 나중에 처리 및 처리를위한 오토 클레이브 비닐 봉투에 사용되는 판을 수집합니다.
  9. 일단 당신이 새로운 유전자형을 테스트 할 수있는 실험의 충분한 수를 수행했습니다. 유전자형 당 10-15 시험 분석을 위해 충분하다.

5. 사양에 따라 데이터 분석에스

  1. 편의를 엑셀 (마이크로 소프트) 또는 추가 통계 분석을 위해 컴퓨터에서 원점 (원점 연구소)와 같은 데이터 시트에 데이터를 전송합니다. 한 열에서 두 번째 열 빛 사분면에있는 동물의 수와 플레이트 ( "중립"애벌레 포함) 동물의 총 세 번째 어둠 속에서 동물의 숫자를 정렬합니다.
  2. 다음 공식을 사용하여 각 실험 어둠의 선호 지수 (PREF)를 계산
    PREF (농도) = (어둠 속에서 애벌레 수 - 유충의 수에 비추어) / 유충의 총 수
  3. 그룹에 대한 적절한 분석과 통계적 데이터 집합을 비교합니다. 여기, 우리는 통계적으로 두 그룹을 비교하는 윌 콕슨이 테스트를 사용합니다. Tukey의 다중 비교와 ANOVA 테스트는 사후 정규 분포 가정이 매니 폴드 그룹에 비해 만족하는 경우 테스트가 수행 할 수 있습니다.
  4. 일주기에 따라 라인과 시점 사이에 명확하게 비교를 보여주는 그래프를 확인합니다. WE 사용 근원 소프트웨어 (원점 연구소) 통계적 유의성을 테스트하고 적절한 그래프를 생성하지만, 다른 통계 소프트웨어가 도움이 될 수 있습니다.

결과

프로토콜은 위에서 설명한 다음, 우리는 야생형 캔톤-S의 초기 번째 애벌레 경기장에서 빛 어두운 환경은 두 개의 서로 다른주기 시간 CT0 및 CT12에 비행 테스트. 성인은 12 시간 빛을 12 시간 어두운 양육하고 12 시간 동안 알을 낳기 위해 남았다. 유충 같은 빛을 어두운 정권 이틀간 성장. 우리는 일정한 조건 (생체 시계의 실행 무료)에서주기 변조를 테스트하고 싶어하기 때문에 테스트 (그림 3...

토론

설명 빛 환경 테스트는 애벌레 타고난 photobehavior을 활용합니다. 분석은, 설정하기 쉬운 저렴한 비용으로 많은 반복을 허용하고 빛을 감지 및 처리에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 실험 패러다임은 개인이 밝거나 어두운 선호 얼마나 많은 상대적으로 신속하게 정량 할 수 있습니다. 이러한 기본 설정은 원유 백분율로 또는 양자 택일 환경 지수 (PREF)로 표시 할 수 있습니다. PREF는 동물의 차이로 ...

공개

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 말

우리는 유익한 토론 프리 생물학, 대학의학과 동료 감사합니다. 우리는 비행 주식을 제공 블루밍턴 주식 센터 주셔서 감사합니다. 이 작품은 재정적 스위스 국립 과학 재단 (PP00P3_123339)와 SGS에 벨 룩스 재단에 의해 지원되었다

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarSigma-AldrichA5093-500G2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland
Petri dishesGreiner Bio-One GmbH63318090-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria
LEDs LampOSARAM80012 WhiteLED lamp, 80012 White
Environment MeterPCEPCE EM882Lux, Temp, RH%
Thermostatic cabinetAqua Lytic (Liebherr)ET636-6
Light timerTimer T6185.104230V/50HZ (check specifications for your country)
Universal thermostatConradUT200
HumidifierBoneco
Balck tapeTesa5 cm
GlueUhu
lncubator lampPhillipsSofttone5W
Timer clockZilissZiliss, Switzerland
Excel SoftwareMicrosoftExcel
Origin Software 8.5OriginLab
Backer YeastMigros Switzerland
Iron support stand 17X28CMFisher ScientificS47808
Acetic acidSigma AldrichA6283-100ML20% acetic acid dilluted in H2O
Red light lampPhillipsPFE712E*8C
Spatula Fisher Scientific14-373-25A
Power supplyEAEA PS 2042-06BOptional
Aluminium foilPrix Coop
HeaterGOONNSB200C
Microwave OvenIntertronic
Standard corn meal fly food
Destilled water

참고문헌

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