Свет Анализ предпочтений по изучению врожденных и суточного Регулируемые Photobehavior в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки

Резюме

Здесь мы опишем свет-темнота предпочтение тест на личинки дрозофилы. Этот препарат обеспечивает информацию о врожденных и регулирования циркадных светочувствительных и обработки photobehavior.

Аннотация

Свет выступает в качестве экологического сигнала для управления поведением животных на различных уровнях. Дрозофилы личиночной нервной системы используется как уникальная модель ответить на основные вопросы о том, как свет информация обрабатывается и распределяется между быстрым и циркадные поведения. Личинок Drosophila отображения стереотипное поведение избежания при воздействии света. Для исследования поведения света зависит сравнительно простые свет-темнота тесты предпочтения могут быть применены. У позвоночных и членистоногих нейронных путей, участвующих в зондирования и обработки визуальной входы частично пересекаются с обработкой светового циркадные информации. Интересный вопрос о том, как светочувствительные системы и циркадных системы взаимодействуют держать поведенческие выходы координируется остается мало изученной. Дрозофилы влияют биологические модели подходить к этим вопросам, в связи с небольшим числом нейронов в головном мозге и наличие генетических инструментов для нейронов MANIPULAtion. Представленные свет-темнота предпочтение анализа позволяет исследовать спектр визуальных поведения, включая контроль циркадных фототаксиса.

Введение

Здесь мы опишем поведенческого анализа, основанного на личиночной предпочтение темным (или света). Личинки реагируют с сильным и фотонегатив стереотипные реакции во время кормления этапах (до начала L1 L3) ^1. Анализ направлен на оценку photophobic поведение личинок и сравнивает светлого или темного предпочтение группы личинок свободно перемещаться в чашке Петри покрытых агаром. Такой поведенческий анализ не только предоставляет информацию о чувствительности, интеграции и временных пластичность зрительной системы, она также обеспечивает подсказки о том, чувствительность к свету и его процесс контролируется циркадные системы.

Глаз дрозофилы личиночной (также называемые Bowlig органной; BO), является основным органом для восприятия света. Каждый глаз состоит из 12 фоторецепторов (PR), восемь ОР выразить зеленый чувствительных rhodopsin6 (RH6) и четыре ОР выразить сине-чувствительные rhodopsin5 (RH5) ^2,3. В дополнение к ОР, ALSО классе IV multidendritic нейронов, которые охватывают личиночной стенки тела, были определены в ответ на вредные интенсивности света ^4,5. Известно также, что кардиостимулятора нейронов расположены в центральной личиночной мозга выражают светочувствительных белков криптохрома (Cry), который действует как внутренние часы синий датчик света в мозге ^6,7. Интересно photophobicity диких животных типа показывает циркадный компонент в различные моменты времени в течение дня и ночи при тестировании с этим анализом. Ответы на свете нагула личинок L3 показал сильнее photophobicity на рассвете и нижней photophobicity в сумерках при испытании на свет-темнота предпочтение ^7. Интересно только Rh5-PRS необходимы для избежания света, в то время Rh6-PRS необязательны. Оба, Rh5-ОР и Rh6-PRS участвуют в сбросе молекулярных часов света ^8. Cry путей должно быть согласовано с другими светочувствительных пути, чтобы организовать соответствующие поведенческие выход втечение дня. Ацетилхолина в ОР, играет существенную роль в свете поведения расторжения договора, а также увлечение молекулярных часов. Блокирование ацетилхолина нейротрансмиссией от ПР циркадные нейроны кардиостимулятора снижает photophobic ответ в свет-темнота предпочтение анализа ^8. Используя тот же анализ, две симметричные пары нейронов недавно были определены для переключения света предпочтение третьего личиночного возраста дрозофилы ^9. Эти две пары нейронов может функционировать в конце личиночной стадии, когда животные оставляют еду предположительно найти подходящий сайт pupariation. Тем не менее, вопрос о том, зрительных путей взаимодействия и контроля личиночной визуальное поведение в циркадных образом остается в значительной степени без ответа. Свет анализа предпочтения позволяет проводить сравнения между циркадные моменты времени, Шнуры и циркадные государством под различные качества света. Анализ может быть легко получено и недорогой и была полезна Ранее яN несколько лабораторий для описания и изучения свете полученных поведения в личинку.

протокол

1. Разведение мальков

1. Хранить летать штаммов или генетических кресты в массовой культуре при 25 ° С на кукурузу средней еды при 12-часовой световой 12 ч темноты в муху инкубатор оснащен света и таймер.
2. Развести спонсор дрожжи в воде с образованием жидкости, пасты (10 г дрожжей спонсор разбавляют 3-4 мл дистиллированной H ₂ O). Добавить небольшое падение в пищу кукурузную муку и охватывают флаконов. Дайте высохнуть в течение не менее одного часа, чтобы избежать взрослых мух придерживаться дрожжи пасты. Ввод небольшую каплю дрожжи разводят в воде на поверхность пищевого продукта может повысить яйцекладки. Альтернативно пекарь дрожжи пасты, 20%-ной уксусной кислоты (AcOH) (Sigma Aldrich, Швейцария A6283-100мл) могут быть использованы. Для этого опустите кончик ватной палочки на решения и распространение на поверхности пищи кукурузной муки.
3. Положите взрослых мух (по крайней мере четырех дней, но не ранее, чем за десять дней) в кукурузе флаконов еды еды. Поместите достаточно взрослым в каждую пробирку для того, чтобы получить достаточную личинки повторить предпочтениетест несколько раз и позволяют статистического сравнения. Для генетического кресты, мы обычно используем, как минимум, 20 женщин и мужчин на 5-10 флаконе, но некоторые линии требуют больше женщин, для получения достаточной личиночной потомство.
4. Разрешить взрослым, чтобы отложить яйца в течение 12 часов и передавать их на новые флаконы. Взрослые могут быть переданы в утренние и вечерние часы. Мы обычно взрослые передачи в течение семи-десяти дней, и при необходимости принять новые взрослые.
5. Храните яйца коллекций каждые 12 ч в инкубаторе и отращивать личинки при 25 ° С, 12-ч света-12-ч темноты и 60% влажности. Для проверки на циркадный компоненты визуального личинки ходу поведение постоянной темноте (DD) 48 ч после сбора яйцо (соответствующие двум-свет-темнота цикла). Для этого используйте отдельный инкубатор без света, но сохранить все другие условия, такие как температура и влажность идентичны. Будьте уверены, чтобы передать флаконов DD инкубатор просто до перехода на темную фазу. Перед перемещением флаконах по АнофER инкубатор положить флаконов в картонной коробке или оберните флаконы с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить воздействие света во время передачи (упаковки в картонные коробки или упаковки должно быть сделано во время «огни, четвертом, этапе" до сдвига между инкубаторы). Не позволяют животным любого освещенности после этого момента и до начала экспериментов.
6. После 4 дней (84 до 108 часов от откладки яиц) собирают ранней L3 (питающихся личинок) в моменты времени для тестирования (см. 4. Свет тесте предпочтений, точки. 4.4.).

2. Тестовая конфигурация

1. Выполните эксперименты в темной комнате с постоянной температурой и влажностью.
2. Чтобы сохранить два квадранта чашку Петри в темноте, покрывают крышкой с черной лентой и алюминиевой фольги. Для того, чтобы сделать это, отметьте центр крышки окружности. Также отмечают четыре точки на границе крышки 90 ° разделения между ними. Чтобы было легче, нарисуйте 20 см квадрат, разделенный на четыре сектора длиной 10 см налист бумаги или с помощью компьютера. Cut 10 см квадраты алюминиевой фольги и черной лентой (рис. 1А). Крышка два противоположных квадрантах склеиванием их алюминиевой фольгой, а первый слой и черный ленту, закрывающую его, быть осторожными, чтобы охватить также граница крышки.
   В последние два слегка различных форм этого анализа были использованы. Мы здесь использовать "четверть тарелка" анализ, в котором чашку Петри разделен на четыре равные части ^10. В качестве альтернативы "Half-тарелка" Анализ чашке Петри делится половиной (половина на свету, половина в темноте) ^1,7,8. До сегодняшнего дня никаких существенных различий между двумя анализах не было опубликовано.
3. Клей лист квадранта, такие как той, которая используется для маркировки крышек прямо под источником света на столе. Отметить окружности чашке Петри с центром на пересечении квадрантах. Используйте знаки в качестве эталона для Положите тест-пластины всегда в том же положении под источником света.
4. Установитьлампа, либо простой белый свет лампы (Филлипс, Softtone 5W) или светодиодные лампы (LED лампы, 80012 белый, Osram) выше чашку Петри с помощью стенда железа поддержки (Fisher Scientific, S47808). Регулировка по высоте таким образом, что весь пластина тест однородно освещена. Мы настоятельно рекомендуем использовать светодиодные лампы, так как они выбрасывают больше определенных длин волн, чем обычные лампочки. Кроме того Светодиоды излучают меньше тепла.
5. Отрегулируйте интенсивность света при помощи фотометра (Environment метр PCE EM882). Для достижения требуемой интенсивности света 350-760 лк, переместить лампу вверх или вниз по мере необходимости. Подключение лампы регулируемый источник питания дает большую гибкость при изменении интенсивности без перемещения огня (рис. 1В).

3. Плиты Подготовка

1. Сделать 200 мл 2,5% агара (Sigma-Aldrich, Швейцария A5093-500G) с двойной дистиллированной воде (Millipore).
2. Поместите чашку Петри на столе (90-мм в диаметре;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Австрия) в строках, чтобы обливание горячей агарозы.
3. Варить агарозы в микроволновой печи, пока раствор не полностью прозрачен и жидкости. Убедитесь, что жидкий раствор не содержит пузырьков. ВНИМАНИЕ: Транспорт тщательно к столу, так как решение может быть очень горячим!
4. Налейте горячую агарозы в чашках Петри, пока вся поверхность не гомогенно покрыта тонким слоем раствора, около двух или трех миллиметров достаточно. Будьте быстры, чтобы предотвратить затвердевание агарозы перед нанесением покрытия все пластины. Пусть пластины остыть. Хранить пластины при комнатной температуре и использовать их только в тот же день подготовки.

4. Тест светлых предпочтения

1. Работа под красный свет в условиях эксперимента помещение для предотвращения воздействия света перед тестом с Drosophila не может ощущать красный длины волны света. Использование красного света (Phillips, PFE712E * 8), установленный в лампу для освещения тон место для работы.
2. Поддерживайте температуру через все эксперименты при температуре 25 ° C. Управление комнатной температуре с помощью прибора нагреватель или охлаждение, если необходимо.
3. Возьмите немного еды из флаконов выращиваемые для двухдневных циклов при постоянной темноте (из раздела 1). Так как личинки, как правило, рытье на поверхность пищевого продукта, принимать самый верхний слой (примерно 5 мм) с помощью шпателя (Fisher Scientific, 14-373-25А). Распространение еду на внешней стороне крышки чашки Петри, добавить немного воды и аккуратно перемешать лопаточкой.
4. Сбор кормления личинок L3 от еды. Как свет предпочтение будет испытан, выбирая только ранний / кормления личинок L3 имеет решающее значение, так как отрицательный фототаксис обеспечена. Поздно / блуждающих личинок L3 или большие личинки ползают на еду по-видимому уже переключили свое photobehavior. Кормление личинок L3 (отрицательный phototactic) может быть признано, поскольку их передней дыхальцами открыты, и выступающий наружу в пальцев, как формы. Задние дыхальцаы имеют три отверстия каждого, и четыре группы больших разветвленных волосков. Слюнные железы распространяется на втором брюшном сегменте ^11. Постановка личинку под микроскопом удобно в то время как ни один белый огонь не должен быть использован. Красная лампа свет необходим для освещения личинок, если постановка под стереоскопическим микроскопом перед экспериментами не требуется.
5. Вымойте кратко личинки в водопроводной воде и собирают ранней кормления личинок третьего возраста (все еще в красный свет). Перед переносом личинок испытательной пластины, возьмите личинок с влажной кистью и тщательно поглощать избыток воды с бумажным полотенцем или фильтровальной бумагой. Не сушите личинки слишком чрезмерно, так как он может повредить животным и влияют на его поведение.
6. Используя влажную кисть тщательно передачи личинок на пластинах. Поместите группу приблизительно 30 личинок в центре пластины. Закройте планшет крышкой уже подготовлена ​​с квадранта и установите пластину под источником света, готовы для эксперимента (см. разделния 2).
7. Включите лампы белого света и включить таймер. Пусть личинки свободно перемещаются на пластине в течение 5 мин, а затем быстро снимите крышку и подсчитать количество личинок в темноте и в свете квадранта. Маркировка положение каждой личинки с маркером может облегчить подсчета. Альтернативно сфотографировать тарелку и рассчитывать апостериорно. Личинки показывает неясно предпочтение свет, как личинки ползают по стенам или закапывания в агар следует рассматривать как нейтральную предпочтения и просто быть включены в общее количество личинок, когда свет индекса рассчитывается предпочтения.
8. После подсчета, отказаться от пластины с личинками и заменить на новые пластины теста для следующего эксперимента. Отработанное пластин в автоклаве пластиковый пакет для последующей обработки и утилизации.
9. После выполнения достаточного количества экспериментов нового генотипа могут быть проверены. 10-15 испытаний на генотип достаточны для анализа.

5. Данные анас

1. Для удобства передачи данных в таблице данных как Excel (Microsoft) или Происхождение (Origin Lab) на компьютере для дальнейшего статистического анализа. Расположить в одном столбце, количество животных в темноте, во второй колонне количество животных в свет квадрантов, а в третьем общем животных в пластине (в том числе "нейтральный" личинки).
2. Вычислить предпочтение индекс (PREF) для темноты для каждого эксперимента с использованием следующей формулы:
   Ап (темнота) = (количество личинок в темных - количество личинок в свет) / общее число личинок
3. Сравнение статистически набор данных с соответствующей анализ для групп. Здесь мы используем тест Вилкоксона для сравнения статистически две группы. Тест ANOVA с несколькими сравнения Тьюки постфактум тест может быть сделано, если допущению о нормальном распределении выполняется в группе сравнения многообразии.
4. Сделать графики, которые ясно показывают, сравнений между линиями и временных точках вдоль дневного цикла. Wиспользование электронной происхождения программного обеспечения (Origin Lab) для проверки статистической значимости и создания соответствующих графиков, но и любой другой статистическое программное обеспечение может быть полезным.

Результаты

Следуя протоколу, описанному выше, мы тестировали свет-темнота предпочтение в начале третьей личиночной стадионе дикого типа Canton-S летает на двух различных циркадных раз CT0 и CT12. Взрослые воспитывали 12-ч света-12-ч темноты и оставили, чтобы отложить яйца в течение 12 часов. Личинки растут в...

Обсуждение

Тест светлых предпочтения описано использует личиночной врожденной photobehavior. Анализ легко установить, позволяет много повторений по низкой цене и получаем информацию о свете зондирования и обработки. Экспериментальная парадигма позволяет относительно быстро количественная, сколько ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	A5093-500G	2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland
Petri dishes	Greiner Bio-One GmbH	633180	90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria
LEDs Lamp	OSARAM	80012 White	LED lamp, 80012 White
Environment Meter	PCE	PCE EM882	Lux, Temp, RH%
Thermostatic cabinet	Aqua Lytic (Liebherr)	ET636-6
Light timer	Timer T	6185.104	230V/50HZ (check specifications for your country)
Universal thermostat	Conrad	UT200
Humidifier	Boneco
Balck tape	Tesa		5 cm
Glue	Uhu
lncubator lamp	Phillips	Softtone	5W
Timer clock	Ziliss		Ziliss, Switzerland
Excel Software	Microsoft		Excel
Origin Software 8.5	OriginLab
Backer Yeast	Migros Switzerland
Iron support stand 17X28CM	Fisher Scientific	S47808
Acetic acid	Sigma Aldrich	A6283-100ML	20% acetic acid dilluted in H2O
Red light lamp	Phillips	PFE712E*8C
Spatula	Fisher Scientific	14-373-25A
Power supply	EA	EA PS 2042-06B	Optional
Aluminium foil	Prix Coop
Heater	GOON	NSB200C
Microwave Oven	Intertronic
Standard corn meal fly food
Destilled water