Luce Preferenza Assay per studiare Innata e circadiano Photobehavior Regolamentato<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Riepilogo

Qui si descrive un test di preferenza chiaro-scuro per Drosophila larva. Questo test fornisce informazioni sulla regolazione innata e circadiano di luce di rilevamento ed elaborazione photobehavior.

Abstract

Atti luce come segnale ambientale per controllare il comportamento degli animali a vari livelli. Il sistema nervoso Drosophila larvale è usato come un modello unico per rispondere alle domande di base su come le informazioni luce viene elaborato e condiviso tra i comportamenti rapidi e circadiano. Visualizzare larve di Drosophila un comportamento di evitamento stereotipata quando esposti alla luce. Per studiare i comportamenti crepuscolare relativamente semplici test preferenza luce-buio possono essere applicati. Nei vertebrati e artropodi i percorsi neurali coinvolti nella rilevazione ed elaborazione input visivi si sovrappongono parzialmente a quelle di elaborazione photic informazioni circadiano. La questione affascinante di come il sistema di rilevamento della luce e il sistema circadiano interagiscono per mantenere uscite comportamentali coordinati rimane largamente inesplorato. Drosophila è un modello impatto biologico affrontare questi problemi, a causa di un piccolo numero di neuroni nel cervello e la disponibilità di strumenti genetici per MANIPUL neuronalezione. Il saggio di preferenza chiaro-scuro presentato consente l'indagine di una serie di comportamenti visivi tra cui il controllo circadiano di fototassi.

Introduzione

Qui si descrive un test comportamentale basato sulla preferenza delle larve per scuro (o chiaro). Larve reagire con una risposta photonegative forte e stereotipie durante le fasi di foraggiamento (da L1 a L3 presto) ^1. Il saggio è volto a valutare il comportamento photophobic della larva e confronta la preferenza chiaro o scuro di un gruppo di larve di muoversi liberamente in una capsula di Petri rivestito con agar. Questa analisi comportamentale fornisce non solo informazioni sulla sensibilità, l'integrazione e temporale plasticità del sistema visivo, fornisce ulteriori suggerimenti su come sensibilità alla luce e il suo processo è controllato dal sistema circadiano.

Il larvale occhio Drosophila (anche chiamato Organo Bowlig; BO), è il principale organo per la percezione della luce. Ogni occhio è composto da 12 fotorecettori (PR), otto PR esprimono il verde-sensibile rhodopsin6 (rh6) e quattro PR esprimere il blu-sensibile rhodopsin5 (RH5) ^2,3. Oltre a PR, also di classe IV neuroni multidendritic, che coprono la parete del corpo larvale, sono stati identificati per rispondere alle nocivi intensità di luce ^4,5. È anche noto che i neuroni pacemaker situati nel cervello larvale centrale esprimono la proteina sensibile alla luce Cryptochrome (Cry) che funge da sensore di luce blu orologio intrinseca all'interno del cervello ^6,7. Curiosamente photophobicity di animali di tipo selvatico mostra un componente circadiana a tempi diversi durante il corso del giorno e della notte durante il test con questo saggio. Le risposte alla luce di foraggiamento L3 larva hanno mostrato forte photophobicity all'alba e photophobicity inferiore al crepuscolo durante il test di preferenza luce-buio ^7. È interessante notare che solo RH5-PR sono necessari per evitare la luce, mentre Rh6-PR sono superflui. Entrambi, RH5-PR e Rh6-PR sono coinvolti nella regolazione dell'orologio molecolare dalla luce ^8. Il percorso Cry deve essere coordinata con gli altri percorsi di rilevazione della luce di orchestrare un appropriato uscita comportamentale nelcorso della giornata. Acetilcolina nel PR gioca un ruolo essenziale nel comportamento di evitamento luce così come trascinamento dell'orologio molecolare. Blocco acetilcolina neurotrasmissione da PR a neuroni pacemaker circadiano riduce la risposta fotofobica nella preferenza saggio luce-oscurità ^8. Impiegando lo stesso saggio, due coppie simmetriche di neuroni sono state recentemente identificate per commutare la preferenza luce del terzo stadio larvale di Drosophila ^9. Queste due coppie di neuroni può essere funzionante durante ultime fasi larvali, quando gli animali lasciano il cibo per trovare presumibilmente un sito pupariation appropriato. Tuttavia, la questione di come le vie visive interagiscono e controllano il comportamento visivo larvale in modo circadiano rimane in gran parte senza risposta. Il saggio di preferenza luce consente confronti tra momenti circadiani, volano linee e statali circadiano con diverse qualità di luce. Il saggio è facilmente preparato e poco costoso ed è stato utile in precedenza in diversi laboratori per descrivere e studiare il comportamento derivato luce nella larva.

Protocollo

1. Allevamento larvale

1. Tenere volare ceppi o incroci genetici nella cultura di massa a 25 ° C su mais pasto medio in un 12-ore di luce a 12 ore di buio in una mosca incubatore dotato di luce e timer.
2. Diluire sostenitore lievito in acqua per formare una pasta fluida (10 g di lievito sostenitore diluita con 3-4 ml di H ₂ O distillata). Aggiungere una piccola goccia per il pasto di mais e coprire le fiale. Lasciare asciugare per almeno un'ora per evitare di mosche adulte attaccare alla pasta di lievito. Mettere una piccola goccia di lievito diluito in acqua sulla superficie del cibo può migliorare ovideposizione. Alternativamente fornaio lievito pasta, acido acetico 20% (AcOH) (Sigma Aldrich, Svizzera A6283-100ml) può essere utilizzato. Per questo, immergere la punta di un Q-tip sulla soluzione e diffusione sulla superficie alimentare farina di mais.
3. Mettere mosche adulte (almeno quattro giorni, ma non più di dieci giorni) in farina di mais fiale alimentari. Mettere abbastanza adulti in ciascuna provetta per ottenere larve sufficiente ripetere la preferenzaprovare diverse volte e la comparazione statistica. Per incroci genetici, si utilizzano in genere un minimo di 20 femmine e maschi 5-10 per flaconcino, ma alcune linee richiediamo più femmine per ottenere un sufficiente prole larvale.
4. Consentire agli adulti di deporre le uova per 12 ore e trasferirle a nuove fiale. Gli adulti possono essere trasferiti al mattino e alla sera. Noi di solito trasferiamo adulti per sette-dieci giorni e se necessario prendere nuove adulti.
5. Mantenere le collezioni d'uovo scattate ogni 12 ore in incubatrice e far crescere le larve a 25 ° C, 12 ore di luce a 12 ore di buio e 60% di umidità. Per eseguire il test per i componenti circadiani di movimento comportamento visivo larve di buio costante (DD) 48 ore dopo la raccolta delle uova (corrispondente a cicli di due-luce-buio). Per questo, utilizzare un incubatore a parte senza luce ma mantenere tutte le altre condizioni quali la temperatura e l'umidità identici. Accertarsi di trasferire le fiale al DD incubatrice poco prima del passaggio alla fase di buio. Prima di spostare le fiale di another incubatore messo fiale in una scatola di cartone o di avvolgere i flaconcini con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce durante il trasferimento (imballaggio in scatole di cartone o imballaggio deve essere fatto durante la "luci-on fase" prima del passaggio tra incubatori). Evitare che gli animali da qualsiasi esposizione alla luce dopo questo punto e fino a inizio esperimenti.
6. Dopo 4 giorni (84-108 ore dalla deposizione delle uova) raccogliere presto L3 (alimentazione larve) ai punti di tempo per essere testato (vedi 4. Leggera preferenza prova, punto. 4.4.).

2. Configurazione di test

1. Effettuare esperimenti in una stanza buia con temperatura costante e umidità.
2. Per mantenere due quadranti della piastra Petri nelle tenebre, coprire il coperchio con del nastro bianco e un foglio di alluminio. Per fare così, segnare il centro della circonferenza coperchio. Anche segnare quattro punti nel bordo del coperchio con 90 ° di separazione fra loro. Per rendere più facile, disegnare un quadrato 20 centimetri diviso in quattro quadranti di 10 cm di lunghezza su unfoglio di carta o con l'aiuto di un computer. Tagliare 10 centimetri quadrati di carta stagnola e nastro nero (Figura 1A). Coprire due quadranti opposti incollando un quadrati di foglio di alluminio, come primo strato e il nastro nero che copre esso, fare attenzione a coprire anche il bordo del coperchio.
   In passato sono stati utilizzati due forme leggermente differenti di questo test. Noi qui usiamo il saggio "quarter-plate", in cui il piatto Petri è diviso in quattro quarti uguali ^10. Nel saggio "half-plate" alternativa la piastra di Petri è diviso metà (metà esposto alla luce, metà in oscurità) ^1,7,8. Fino ad oggi, senza differenze significative tra i due dosaggi è stato pubblicato.
3. Colla un foglio quadrante come quello utilizzato per marcare i coperchi proprio sotto la sorgente luminosa sul tavolo. Contrassegnare la circonferenza di un piatto Petri centrata sull'intersezione quadranti. Utilizzare i contrassegni come riferimento per posizionare la piastra di prova sempre nella stessa posizione sotto la sorgente di luce.
4. Installare unlampada, o una semplice lampadina bianca (Phillips, Soft tone 5W) o di una lampada a LED (lampada LED, 80012 Bianco, Osram) al di sopra della piastra di Petri con l'aiuto di un cavalletto di sostegno in ferro (Fisher Scientific, S47808). Regolare l'altezza in modo che l'intera piastra di prova viene illuminata in modo omogeneo. Si consiglia vivamente l'utilizzo di lampade LED dal momento che emettono le lunghezze d'onda più specifici rispetto alle tradizionali lampadine. Inoltre LED emettono meno calore.
5. Regolare l'intensità della luce con l'aiuto di un fotometro (Ambiente PCE EM882). Per raggiungere l'intensità luminosa necessaria di 350-760 lux, la lampada spostare su o giù come richiesto. Collegare la lampada ad un alimentatore regolabile maggiore versatilità per cambiare intensità senza spostare la lampada (Figura 1B).

3. Piatti Preparazione

1. Fare 200 ml di agar 2,5% (Sigma-Aldrich, Svizzera A5093-500G) con acqua bidistillata (Millipore).
2. Porre piastre Petri su un tavolo (90 mm di diametro;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria) in file per consentire versando caldo agarosio.
3. Bollire l'agarosio in un forno a microonde fino a quando la soluzione è completamente trasparente e fluida. Assicurarsi che la soluzione liquida non contiene bolle. ATTENZIONE: Trasporti con attenzione la tabella poiché la soluzione può essere molto caldo!
4. Versare agarosio caldo in piastre Petri finché l'intera superficie viene omogeneamente ricoperta con un sottile strato di soluzione, circa due o tre millimetri sono sufficienti. Sii veloce per evitare di agarosio solidificare prima di tutte le lastre di rivestimento. Lasciate raffreddare le piastre. Conservare le piastre a temperatura ambiente e utilizzarle solo lo stesso giorno della preparazione.

4. Test di preferenza Luce

1. Operare in condizioni di luce rosso in camera esperimento di impedire l'influenza della luce prima della prova Drosophila poiché non è in grado di percepire le lunghezze d'onda di luce rossa. Utilizzare una lampadina rossa (Phillips, PFE712E * 8) montato in una lampada per illuminare tha posto per lavorare.
2. Mantenere la temperatura in tutti gli esperimenti a 25 ° C. Controllo della temperatura ambiente mediante un dispositivo di riscaldamento o di raffreddamento, se necessario.
3. Prendete un po 'di cibo dai flaconi allevati per cicli di due giorni in buio costante (da sezione 1). Poiché larve sono solitamente scavando sulla superficie del cibo, prendere lo strato più elevato (circa 5 mm di profondità) con l'aiuto di una spatola (Fisher Scientific, 14-373-25A). Distribuire il cibo sul lato esterno di un piatto coperchio Petri, aggiungere un po 'd'acqua e mescolare delicatamente con la spatola.
4. Raccogliere alimentazione L3 larve dal cibo. Come preferenza luce sarà testato, scegliendo solo all'inizio / nutrire le larve L3 è di fondamentale importanza in quanto la fototassi negativo è assicurato. Tardo / errante L3 larve o grande larva strisciando sul cibo presumibilmente già acceso il loro photobehavior. Nutrire larve L3 (phototactic negativo) può essere riconosciuto perché i loro spiracoli anteriori sono aperte e sporgenti verso l'esterno in una forma di dita. Il spiracle posteriores hanno tre aperture ciascuno, e quattro gruppi di grossi peli ramificati. Le ghiandole salivari estendono al secondo segmento addominale ^11. Messa in scena di larva al microscopio è conveniente, mentre nessuna luce bianca deve essere usato. Una lampada spia rossa è necessario illuminare le larve, se messa in scena sotto microscopio stereoscopico prima è richiesto esperimenti.
5. Lavare larve rapidamente in acqua corrente e raccogliere precoce alimentazione larve di terza instar (ancora in luce rossa). Prima di trasferire le larve alla piastra di prova, prendere le larve con un pennello bagnato e assorbire accuratamente l'acqua in eccesso con un tovagliolo di carta o carta da filtro. Non asciugare larve troppo eccessivamente in quanto potrebbe danneggiare l'animale e influenzare il suo comportamento.
6. Utilizzando il pennello bagnato trasferire accuratamente le larve di piatti. Posizionare un gruppo di circa 30 larve al centro della piastra. Coprire la piastra con il coperchio già preparato con i quadranti e impostare la piastra sotto la sorgente di luce pronto per l'esperimento (vedi sezzione 2).
7. Accendere la lampada luce bianca e avviare il timer. Lasciare la larva muoversi liberamente sulla piastra per 5 minuti, quindi rimuovere rapidamente il coperchio e contare il numero di larve al buio e nei quadranti luminosi. Marcare la posizione di ogni larva con un pennarello può facilitare il conteggio. In alternativa, fare una foto del piatto e contare a posteriori. Larve mostrando preferenza luce poco chiara, come larve strisciando sulle pareti o scavare nel agar deve essere considerato come preferenza neutro e solo essere incluso nel numero totale di larve quando l'indice preferenza luce viene calcolato.
8. Dopo il conteggio, scartare la piastra con larve e sostituirla con una nuova piastra di prova per il prossimo esperimento. Raccogliere lastre utilizzate in un sacchetto di plastica autoclave per la manipolazione e lo smaltimento tardi.
9. Dopo aver eseguito un numero sufficiente di esperimenti di un nuovo genotipo può essere testata. 10-15 prove per genotipo sono sufficienti per l'analisi.

5. L'analisi des

1. Per comodità di trasferire i dati ad un modulo dati in Excel (Microsoft) o Origine (Origin Lab) su un computer per ulteriori analisi statistiche. Disporre in una colonna il numero di animali in buio, in una seconda colonna il numero di animali in quadranti luce e nella terza il totale degli animali nella piastra (comprese larve "neutro").
2. Calcolare l'indice di preferenza (PREF) per il buio per ciascun esperimento utilizzando la seguente formula:
   PREF (buio) = (numero di larve nel buio - numero di larve di luce) / numero totale delle larve
3. Confrontare statisticamente un insieme di dati con un'analisi appropriata per gruppi. Qui, usiamo un test di Wilcoxon per confrontare statisticamente due gruppi. Un test ANOVA con multiple-confronto di un Tukey post hoc test può essere fatto, se normale ipotesi di distribuzione si compie in un confronto di gruppo collettore.
4. Fai i grafici che mostrano chiaramente i confronti tra linee e punti di tempo lungo il ciclo giorno. We l'uso del software Origin (Origine Lab) per testare la significatività statistica e generare grafici appropriati, ma qualsiasi altro software di statistica può essere utile.

Risultati

Seguendo il protocollo descritto in precedenza, abbiamo testato la preferenza chiaro-scuro nei primi mesi del terzo stadio larvale di tipo selvatico Canton-S vola a due diversi tempi circadiani CT0 e CT12. Adulti sono stati allevati 12 ore di luce a 12 ore buio e lasciati a deporre le uova per 12 ore. Le larve crescono i primi due giorni sotto lo stesso regime di chiaro-scuro. Dal momento che abbiamo voluto testare la modulazione circadiana in condizioni costanti (free running dell'orologio circadiano), larve sono s...

Discussione

Il test di preferenza luce descritta sfrutta l'innata photobehavior larvale. Il test è facile da stabilire, permette molte ripetizioni a basso costo e fornisce preziose informazioni di rilevamento e di elaborazione della luce. Il paradigma sperimentale consente relativamente rapida quantificazione di quanti individui preferiscono chiaro o scuro. Tale preferenza può essere visualizzato come percentuale del greggio o in alternativa come Indice di Preferenza (PREF). Il PREF è espresso come differenza di animali che ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	A5093-500G	2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland
Petri dishes	Greiner Bio-One GmbH	633180	90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria
LEDs Lamp	OSARAM	80012 White	LED lamp, 80012 White
Environment Meter	PCE	PCE EM882	Lux, Temp, RH%
Thermostatic cabinet	Aqua Lytic (Liebherr)	ET636-6
Light timer	Timer T	6185.104	230V/50HZ (check specifications for your country)
Universal thermostat	Conrad	UT200
Humidifier	Boneco
Balck tape	Tesa		5 cm
Glue	Uhu
lncubator lamp	Phillips	Softtone	5W
Timer clock	Ziliss		Ziliss, Switzerland
Excel Software	Microsoft		Excel
Origin Software 8.5	OriginLab
Backer Yeast	Migros Switzerland
Iron support stand 17X28CM	Fisher Scientific	S47808
Acetic acid	Sigma Aldrich	A6283-100ML	20% acetic acid dilluted in H2O
Red light lamp	Phillips	PFE712E*8C
Spatula	Fisher Scientific	14-373-25A
Power supply	EA	EA PS 2042-06B	Optional
Aluminium foil	Prix Coop
Heater	GOON	NSB200C
Microwave Oven	Intertronic
Standard corn meal fly food
Destilled water