Essai de préférence la lumière pour étudier innée et circadien Photobehavior Réglementé<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

Résumé

Nous décrivons ici un test de préférence de lumière-obscurité pour Drosophila larve. Ce test fournit des informations sur la réglementation innée et circadien de photobehavior détection et le traitement de la lumière.

Résumé

La lumière agit comme signal environnemental pour contrôler le comportement des animaux à différents niveaux. Le système nerveux des larves de Drosophila est utilisé comme un modèle unique pour répondre aux questions de base sur la façon dont l'information est traitée lumière et partagée entre les comportements rapides et circadien. Larves de drosophile afficher un comportement d'évitement stéréotypé lorsqu'il est exposé à la lumière. Pour étudier les comportements dépendant de la lumière des tests comparables simples de préférence lumière-obscurité peuvent être appliquées. Chez les vertébrés et les arthropodes les circuits neuronaux impliqués dans la détection et le traitement des stimuli visuels se chevauchent partiellement avec celles traitement photic informations circadien. La question fascinante de la façon dont le système de détection de la lumière et le système circadien interagissent pour maintenir sorties comportement coordonné reste largement inexploré. Drosophile est un modèle impact biologique d'aborder ces questions, en raison d'un petit nombre de neurones dans le cerveau et la disponibilité des outils génétiques pour manipul neuronaleation. Le test de préférence de lumière-obscurité présenté permet d'étudier une gamme de comportements visuels, y compris le contrôle circadien de phototaxis.

Introduction

Nous décrivons ici une analyse comportementale basée sur la préférence pour les larves foncé (ou clair). Les larves réagissent avec une réponse forte et stéréotypé photonegative pendant les phases de recherche de nourriture (L1 à L3 tôt) ^1. L'essai a pour but d'évaluer le comportement photophobes de la larve et compare la préférence claire ou foncée d'un groupe de larves se déplaçant librement dans une boîte de Petri revêtue de gélose. Cette analyse comportementale non seulement fournit des informations sur la plasticité sensibilité, l'intégration et temporelle du système visuel, il prévoit en outre des conseils sur la façon de sensibilité à la lumière et son processus est contrôlé par le système circadien.

La larve oeil drosophile (aussi appelé orgue Bowlig; BO), est le principal organe de perception de la lumière. Chaque œil est composé de 12 photorécepteurs (PR), huit PR expriment le rhodopsin6 sensible au vert (rh6) et quatre PR expriment le rhodopsin5 sensible au bleu (RH5) ^2,3. En plus de PR, salo classe neurones multidendritic IV, qui couvrent la paroi du corps larvaire, ont été identifiées pour répondre aux intensités lumineuses nuisibles ^4,5. Il est également connu que les neurones pacemakers situés dans le cerveau des larves central expriment la lumière protéine Cryptochrome sensible (Cry) qui agit comme horloge capteur de lumière bleu intrinsèque dans le cerveau ^6,7. Curieusement photophobicity des animaux de type sauvage montre une composante circadienne à différents moments au cours de la journée et de la nuit lors de l'essai avec ce dosage. Les réponses à la lumière de butinage larve L3 montré fort photophobicity à l'aube et au crépuscule photophobicity inférieur lors des tests de préférence clair-obscur ^7. Il est intéressant que RH5-PR sont nécessaires pour éviter la lumière, tandis que Rh6-PR sont indispensables. Les deux, RH5-PR et Rh6-PR sont impliqués dans réinitialisation de l'horloge moléculaire par la lumière ^8. La voie de Cry doit être coordonnée avec les autres voies de détection de lumière pour orchestrer une sortie comportement approprié dans lecourant de la journée. Acétylcholine dans les PR joue un rôle essentiel dans le comportement d'évitement de lumière ainsi que l'entraînement de l'horloge moléculaire. Blocage de la neurotransmission de l'acétylcholine à partir de neurones PN du stimulateur circadien réduit la réponse photophobes dans le dosage de préférence de lumière-obscurité ^8. Employant le même dosage, deux paires symétriques de neurones ont été récemment identifiées pour passer la préférence lumière du troisième stade larvaire de la drosophile ^9. Ces deux paires de neurones peuvent être fonctionnent pendant les stades larvaires fin, lorsque les animaux quittent la nourriture pour trouver probablement un site de nymphose approprié. Cependant, la question de savoir comment les voies visuelles interagir et de contrôler le comportement visuel des larves de façon circadienne reste largement sans réponse. Le test de préférence la lumière permet des comparaisons entre les points dans le temps circadiens, Soies et l'état circadien sous différentes qualités de lumière. Le test est facile à préparer et peu coûteux et a été utile précédemment in plusieurs laboratoires pour décrire et étudier le comportement dérivé de la lumière dans la larve.

Protocole

1. L'élevage larvaire

1. Gardez voler des souches ou des croisements génétiques dans la culture de masse à 25 ° C sur un milieu de farine de maïs sous un léger 12 h cycle 12-hr sombre dans une mouche incubateur équipé de la lumière et la minuterie.
2. Diluer bailleur de levure dans l'eau pour former une pâte liquide (10 g de levure diluée bailleur de fonds avec 3-4 ml d'eau distillée H ₂ O). Ajouter une petite goutte au maïs nourriture de repas et de couvrir les flacons. Laissez sécher pendant au moins une heure pour éviter les mouches adultes coller à la pâte de levure. Mettre une petite goutte de levure diluée dans l'eau sur la surface de l'aliment peut améliorer la ponte. Sinon levure de boulanger pâte, de l'acide acétique à 20% (AcOH) (Sigma Aldrich, Suisse A6283-100ML) peut être utilisé. Pour ce faire, tremper le bout d'un coton-tige sur la solution et la propagation sur la surface des aliments de farine de maïs.
3. Mettez les mouches adultes (âgés d'au moins quatre jours, mais pas plus de dix jours) dans le maïs flacons alimentaires de repas. Mettez suffisamment d'adultes dans chaque flacon afin d'obtenir des larves suffit de répéter la préférencetester plusieurs fois et permettre une comparaison statistique. Pour croisements génétiques, nous utilisons généralement un minimum de 20 femelles et mâles 5-10 par flacon, mais quelques lignes besoin de plus de femmes à obtenir une progéniture larvaire suffisante.
4. Permettre aux adultes de pondre des oeufs pendant 12 heures et les transférer sur de nouveaux flacons. Les adultes peuvent être transférés dans la matinée et la soirée. Nous transférons habituellement les adultes pendant sept à dix jours et si nécessaire prendre de nouvelles adultes.
5. Gardez les collections d'œufs prises toutes les 12 heures dans l'incubateur et laisser pousser les larves à 25 ° C, le cycle lumière-obscurité de 12 h à 12 h et 60% d'humidité. Pour tester les composants circadiens du comportement visuel mouvement larves à l'obscurité permanente (DD) 48 heures après la collecte des œufs (correspondant à des cycles de deux clair-obscur). Pour cela, utiliser un incubateur séparé sans lumière, mais gardez toutes les autres conditions telles que la température et l'humidité identiques. Assurez-vous de transférer les flacons à la DD incubateur juste avant le passage à la phase d'obscurité. Avant de déplacer les flacons à another incubateur mis flacons dans une boîte en carton ou envelopper les flacons avec du papier d'aluminium pour éviter exposition à la lumière pendant le transfert (emballage en carton ou l'emballage doit être fait lors de la «lumières sur la phase" avant le décalage entre incubateurs). Empêcher les animaux de toute exposition à la lumière après ce moment et jusqu'au début des expériences.
6. Après 4 jours (de 84 à 108 heures de ponte) recueillir début L3 (larves d'alimentation) aux points de temps à tester (voir 4. Essai préférence la lumière, point. 4.4.).

2. Configuration de test

1. Réaliser des expériences dans une pièce sombre avec une température constante et d'humidité.
2. Pour garder deux quadrants de la boîte de Pétri dans l'obscurité, recouvrir le couvercle avec du ruban noir et une feuille d'aluminium. Pour ce faire, marquez le centre de la circonférence du couvercle. Aussi marquer quatre points dans la bordure du couvercle à 90 ° de la séparation entre eux. Pour faciliter les choses, tracer un carré de 20 cm divisé en quatre quadrants de 10 cm de longueur sur unefeuille de papier ou avec l'aide d'un ordinateur. Couper 10 cm carrés de papier d'aluminium et ruban noir (figure 1A). Cover deux quadrants opposés par collage un carré de papier d'aluminium, comme première couche et la bande noire recouvrant, veillez à couvrir également la frontière du couvercle.
   Dans le passé, deux formes légèrement différentes de ce dosages ont été utilisés. Nous utilisons ici le test "quarter-plate", dans lequel la boîte de Pétri est divisée en quatre quartiers égaux ^10. Dans l'alternative essai "demi-plaque" la boîte de Pétri est divisée moitié (moitié exposée à la lumière, la moitié dans l'obscurité) ^1,7,8. Jusqu'à aujourd'hui, aucune différence significative entre les deux essais a été publié.
3. Collez une feuille de quadrant comme celle utilisée pour le marquage des couvercles droit en vertu de la source de lumière sur la table. Marquez la circonférence d'une boîte de Pétri centré sur l'intersection des quadrants. Utiliser les marques de référence à placer la plaque d'essai toujours dans la même position dans la source lumineuse.
4. Installez unelampe, soit une simple ampoule blanche (Phillips, Softtone 5W) ou une lampe LED (lampe LED, 80012 Blanc, Osram) au-dessus de la boîte de Pétri avec l'aide d'une béquille de fer (Fisher Scientific, S47808). Régler la hauteur de façon que la plaque d'essai est tout d'illumination homogène. Nous recommandons fortement l'utilisation de lampes à LED, car ils émettent des longueurs d'onde plus spécifiques que les ampoules classiques. Par ailleurs LED émettent moins de chaleur.
5. Ajuster l'intensité lumineuse à l'aide d'un photomètre (Environnement PCE EM882). Pour atteindre l'intensité lumineuse requise de 350 à 760 lux, déplacer la lampe vers le haut ou vers le bas selon les besoins. Brancher la lampe à une alimentation réglable donne plus de souplesse pour modifier les intensités sans déplacer la lampe (figure 1B).

3. Préparation des plaques

1. Faire 200 ml de 2,5% d'agar (Sigma-Aldrich, Suisse A5093-500G) avec de l'eau distillée deux fois (Millipore).
2. Placez des boîtes de Pétri sur une table (90 mm de diamètre;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Autriche) en rangées pour permettre versant chaud agarose.
3. Faire bouillir l'agarose au micro-ondes jusqu'à ce que la solution est complètement transparent et fluide. Assurez-vous que la solution liquide ne contient pas de bulles. ATTENTION: Transport soigneusement à la table puisque la solution peut être très chaud!
4. Verser chaud d'agarose dans des boîtes de Petri jusqu'à ce que toute la surface est couverte de manière homogène par une couche mince de la solution, de deux ou trois millimètres suffisent. Soyez rapide pour éviter agarose solidifier avant de revêtement toutes les plaques. Laissez les plaques refroidir. Stocker les plaques à température ambiante et les utiliser uniquement le jour même de la préparation.

4. Test de préférence la lumière

1. Travailler dans des conditions de lumière rouge dans la salle d'expérimentation afin d'éviter l'influence de lumière avant l'essai depuis la drosophile n'est pas en mesure de détecter des longueurs d'onde de lumière rouge. Utilisez une ampoule rouge (Phillips, PFE712E * 8) monté dans une lampe pour éclairer til lieu de travail.
2. Maintenir la température à travers toutes les expériences à 25 ° C. la température de la chambre de commande au moyen d'un dispositif de chauffage ou de refroidissement si nécessaire.
3. Prenez un peu de nourriture dans les flacons élevés pour les cycles de deux jours, sous l'obscurité constante (à partir de la section 1). Depuis larves sont habituellement creuse sur la surface de la nourriture, prenez la couche supérieure (environ 5 mm de profondeur) à l'aide d'une spatule (Fisher Scientific, le 14-373-25A). Étaler la nourriture sur la face extérieure d'un couvercle de boîte de Pétri, ajouter un peu d'eau et mélanger délicatement avec la spatule.
4. Recueillir l'alimentation des larves L3 de la nourriture. Comme la lumière préférence sera testé, en choisissant seulement début / alimentation des larves L3 est crucial puisque la phototaxis négative est assurée. Late / errance larves L3 ou grand larve rampant sur la nourriture probablement déjà changé leur photobehavior. L'alimentation des larves L3 (phototactic négative) peut être reconnu parce que leurs stigmates antérieurs sont ouverts et saillie vers l'extérieur dans une forme de doigt. Le stigmate postérieurs ont trois ouvertures chacune, et quatre groupes de grands poils ramifiés. Les glandes salivaires s'étendent au second segment abdominal ^11. Mise en scène larve sous un microscope est commode alors qu'aucune lumière blanche doit être utilisé. Une lampe à lumière rouge est nécessaire pour éclairer les larves si la mise en scène sous le microscope stéréoscopique avant les expériences sont nécessaires.
5. Laver les larves brièvement dans l'eau du robinet et recueillir en début de nourrir les larves de troisième stade (toujours dans la lumière rouge). Avant de transférer les larves de la plaque d'essai, prendre les larves avec un pinceau humide et absorber l'excès d'eau soigneusement avec une serviette en papier ou papier filtre. Ne séchez pas excessivement les larves trop car cela pourrait nuire à l'animal et d'influencer son comportement.
6. En utilisant le pinceau humide transférer soigneusement les larves de plaques. Placer un groupe d'environ 30 larves dans le centre de la plaque. Recouvrir la plaque avec le couvercle déjà préparé avec les quadrants et mettre la plaque sous la source de lumière prêt pour l'expérience (voir section 2).
7. Allumez la lampe de lumière blanche et lancer le chronomètre. Laissez la larve se déplacer librement sur la plaque pendant 5 min, puis retirez rapidement le couvercle et compter le nombre de larves dans l'obscurité et dans les quadrants légers. Repérage de la position de chaque larve avec un marqueur peut faciliter le comptage. Vous pouvez également prendre une photo de la plaque et compter a posteriori. Les larves montrant préférence de lumière claire, comme les larves rampant sur les murs ou creuser dans de la gélose doit être considérée comme préférence neutre et juste être inclus dans le nombre total de larves lorsque l'indice de préférence la lumière est calculée.
8. Après le dépouillement, jeter la plaque avec les larves et les remplacer par une nouvelle plaque d'essai pour la prochaine expérience. Recueillir plaques utilisées dans un sac en plastique autoclave pour la manipulation et l'élimination ultérieure.
9. Une fois que vous avez effectué un nombre suffisant d'expériences, un nouveau génotype peut être testé. 10-15 essais par génotype sont suffisants pour l'analyse.

5. Données Analysis

1. Pour plus de commodité transférer les données à une fiche technique en Excel (Microsoft) ou origine (Laboratoire d'origine) sur un ordinateur pour une analyse statistique. Disposer dans une colonne le nombre d'animaux dans l'obscurité, dans une deuxième colonne le nombre d'animaux dans les quadrants légers et dans la troisième le total d'animaux dans la plaque (y compris les larves "neutre").
2. Calcul de l'indice de préférence (PREF) à l'obscurité pour chaque expérimentation en utilisant la formule suivante:
   PREF (obscurité) = (nombre de larves dans l'obscurité - nombre de larves à la lumière) / nombre total de larves
3. Comparer statistiquement un ensemble de données par une analyse appropriée pour les groupes. Ici, nous utilisons un test de Wilcoxon pour comparer statistiquement les deux groupes. Un test ANOVA avec comparaison multiple de Tukey test post hoc peut être fait, si hypothèse de distribution normale est accomplie dans une comparaison avec un groupe de collecteur.
4. Faire des graphiques qui montrent clairement des comparaisons entre les lignes et de points de temps au long du cycle jour. WE à utiliser le logiciel Origin (Laboratoire d'origine) pour tester la signification statistique et générer des graphiques appropriés, mais tout autre logiciel statistique peut être utile.

Résultats

En suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons testé préférence clair-obscur en début du troisième stade larvaire de type sauvage Canton-S vole à deux fois circadiens différents CT0 et CT12. Les adultes ont été élevés à 12 h à la lumière de 12 heures sombres et laissés à pondre des œufs pendant 12 heures. Larves se développent les deux premiers jours sous le même régime de lumière-obscurité. Comme nous voulions tester modulation circadienne dans des conditions constantes (course libre de l&#...

Discussion

Le test de préférence la lumière décrit tire parti de la photobehavior innée larvaire. Le test est facile à mettre en place, permet de nombreuses répétitions à faible coût et fournit de précieuses informations sur la détection et le traitement de lumière. Le paradigme expérimental permet la quantification relativement rapide du nombre de personnes préfèrent clair ou foncé. Cette préférence peut être affiché sous forme de pourcentages bruts ou encore comme indice de préférence (PREF). Le PREF est e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	A5093-500G	2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland
Petri dishes	Greiner Bio-One GmbH	633180	90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria
LEDs Lamp	OSARAM	80012 White	LED lamp, 80012 White
Environment Meter	PCE	PCE EM882	Lux, Temp, RH%
Thermostatic cabinet	Aqua Lytic (Liebherr)	ET636-6
Light timer	Timer T	6185.104	230V/50HZ (check specifications for your country)
Universal thermostat	Conrad	UT200
Humidifier	Boneco
Balck tape	Tesa		5 cm
Glue	Uhu
lncubator lamp	Phillips	Softtone	5W
Timer clock	Ziliss		Ziliss, Switzerland
Excel Software	Microsoft		Excel
Origin Software 8.5	OriginLab
Backer Yeast	Migros Switzerland
Iron support stand 17X28CM	Fisher Scientific	S47808
Acetic acid	Sigma Aldrich	A6283-100ML	20% acetic acid dilluted in H2O
Red light lamp	Phillips	PFE712E*8C
Spatula	Fisher Scientific	14-373-25A
Power supply	EA	EA PS 2042-06B	Optional
Aluminium foil	Prix Coop
Heater	GOON	NSB200C
Microwave Oven	Intertronic
Standard corn meal fly food
Destilled water