Luz Ensaio Preferências para estudar inata e circadiano Photobehavior Regulamentado<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

Resumo

Aqui nós descrevemos um teste de preferência claro-escuro para Drosophila larva. Este ensaio fornece informações sobre regulação inata e circadiano da luz de sensoriamento e processamento photobehavior.

Resumo

Atos de luz como sinal ambiental para controlar o comportamento de animais em vários níveis. O sistema nervoso Drosophila larval é usado como um modelo único para responder a perguntas básicas sobre como informação de luz é processada e compartilhada entre os comportamentos rápidos e circadiano. Larvas Drosophila exibir um comportamento de evitação estereotipada quando expostos à luz. Para investigar comportamentos dependentes leves testes comparativamente simples de preferência claro-escuro podem ser aplicadas. Em vertebrados e artrópodes as vias neurais envolvidos na percepção e processamento de informações visuais se sobrepõem parcialmente com os de processamento de informações circadiano photic. A questão fascinante de como o sistema de detecção de luz e o sistema circadiano interagem para manter as saídas de comportamento coordenado permanece largamente inexplorado. Drosophila é um modelo de impacto biológico para abordar estas questões, devido a um pequeno número de neurónios no cérebro e na disponibilidade de ferramentas genéticas para manipul neuronalração. O ensaio de preferência claro-escuro apresentado permite a investigação de uma série de comportamentos visuais, incluindo controle circadiano da phototaxis.

Introdução

Aqui nós descrevemos um ensaio comportamental com base na preferência larval para escuro (ou luz). Larvas reagir com uma resposta fotonegativo forte e estereotipados durante os estágios de forrageio (L1 até o início L3) ^1. O ensaio é destinado a avaliar o comportamento photophobic da larva e compara o claro ou escuro preferência de um grupo de larvas de mover-se livremente em uma placa de Petri revestidas com ágar. Este ensaio comportamental não só fornece informações sobre a sensibilidade, a integração temporal e plasticidade do sistema visual, proporciona ainda dicas sobre como sensibilidade à luz e ao seu processo é controlado pelo sistema circadiano.

A Drosophila olho larval (também denominado Órgão Bowlig; BO), é o principal órgão de percepção luminosa. Cada olho é composto de 12 fotorreceptores (PR), oito PRs expressar a rhodopsin6 verde-sensível (RH6) e quatro PRs expressar a rhodopsin5 blue-sensível (RH5) ^2,3. Além de PRs, alsÔ classe IV neurônios multidendritic, que cobrem a parede do corpo larval, foram identificados para responder a intensidades de luz nocivos ^4,5. Sabe-se também que os neurónios do pacemaker situados no centro do cérebro larval expressar a proteína sensível à luz criptocromo (Cry), que age como relógio sensor de luz azul intrínseca dentro do cérebro ^6,7. Curiosamente photophobicity de animais de tipo selvagem mostra um componente circadiano em diferentes pontos de tempo durante o decurso do dia e da noite, quando um teste com este ensaio. Respostas a luz de forrageamento larva L3 mostrou photophobicity forte na madrugada e inferior photophobicity ao entardecer, quando testado para a preferência claro-escuro ^7. Curiosamente só RH5-PRs são necessários para evitar a luz, enquanto RH6-PRs são dispensáveis. Ambos, RH5-PRs e RH6-PRs estão envolvidos em como acertar o relógio molecular pela luz ^8. O caminho Cry deve ser coordenada com as outras vias de luz sensores de orquestrar uma saída de comportamento apropriado nodecorrer do dia. A acetilcolina em RP desempenha um papel essencial no comportamento de evasão luz, bem como o arrastamento do relógio molecular. Bloqueio de neurotransmissão acetilcolina dos PRs aos neurônios marcapasso circadiano reduz a resposta photophobic no ensaio de preferência light-escuridão ^8. Utilizando o mesmo ensaio, os dois pares simétricos de neurónios foram recentemente identificados para exibir a preferência luz do terceiro instar de larvas de Drosophila ^9. Esses dois pares de neurônios pode estar funcionando durante a fase larval final, quando os animais deixam a comida para encontrar provavelmente um site pupariation apropriado. No entanto, a questão de como as vias visuais interagir e controlar o comportamento visual de uma forma larval circadiano permanece praticamente sem resposta. O ensaio de preferência light permite comparações entre os momentos circadianos, voar linhas e estaduais circadiano sob diferentes qualidades de luz. O ensaio é barato e facilmente preparado e tem sido útil anteriormente in vários laboratórios para descrever e estudar a luz comportamento derivado da larva.

Protocolo

1. Larvicultura

1. Mantenha voar estirpes ou cruzamentos genéticos na cultura de massa a 25 ° C em meio a farinha de milho em uma hora de luz 12 ciclo de 12 horas de escuro em uma mosca incubadora equipado com luz e timer.
2. Diluir Backer levedura em água para formar uma pasta fluida (10 g de levedura Backer diluída com 3-4 ml de _H2O destilada). Adicione uma pequena queda para o milho refeição e cobrir os frascos. Deixar secar durante pelo menos uma hora, para evitar moscas adultas adere à pasta de levedura. Colocar uma pequena gota de levedura diluída em água sobre a superfície do alimento pode melhorar a oviposição. Alternativamente pasta de levedura de panificação, ácido acético a 20% (AcOH) (Sigma Aldrich, Suiça A6283-100ml) pode ser usado. Para isso, molhar a ponta de um Q-tip na solução e espalhe sobre a superfície da refeição de milho.
3. Coloque moscas adultas (pelo menos quatro dias de idade, mas não mais do que 10 dias), em farelo de frascos de alimentos. Coloque adultos suficientes para cada frasco, a fim de obter larvas suficiente para repetir a preferênciatestar várias vezes e permitir a comparação estatística. Para cruzamentos genéticos, que normalmente usam um mínimo de 20 fêmeas e machos 5-10 por frasco, mas algumas linhas precisam de mais fêmeas para obter uma prole larval suficiente.
4. Permitem que os adultos põem ovos para 12 horas e transferi-los para novos frascos. Os adultos podem ser transferidas, de manhã e à noite. Costumamos transferir adultos por sete a dez dias e se necessário tomar novas adultos.
5. Manter as colecções de ovo tomadas cada 12 horas na incubadora e deixar crescer as larvas a 25 ° C, 12 horas de ciclo claro-escuro de 12 horas e 60% de humidade. Para testar componentes circadianos de movimento larvas visuais comportamento à escuridão constante (DD) 48 horas após a coleta de ovos (correspondente a dois ciclos claro-escuro). Para isso, use uma incubadora separado, sem luz, mas manter todas as outras condições, tais como temperatura e umidade idênticos. Certifique-se de transferir os frascos para o DD incubadora pouco antes da mudança para a fase escura. Antes de mover os frascos another incubadora colocar os frascos em uma caixa de papelão ou embrulhar os frascos com papel alumínio para evitar a exposição à luz durante a transferência (embalagem em caixa de papelão ou embalagem tem que ser feito durante o "apagar as luzes da fase" antes da mudança entre incubadoras). Impedir que os animais de qualquer exposição à luz após este ponto e até experimentos início.
6. Após 4 dias (84-108 hr de postura de ovos) recolher cedo L3 (larvas de alimentação) nos pontos de tempo para serem testados (ver 4. Luz preferência teste, ponto. 4.4.).

2. Test Setup

1. Realizar experiências em um quarto escuro, com temperatura constante e umidade.
2. Para manter dois quadrantes da placa de Petri em trevas, cobrir a tampa com fita preta e folha de alumínio. A fim de fazer isso, marcar o centro da circunferência da tampa. Mark também quatro pontos na borda da tampa, com 90 ° de separação entre eles. Para torná-lo mais fácil, desenhar um quadrado 20 centímetros dividido em quatro quadrantes, de 10 cm de comprimento em umfolha de papel ou com a ajuda de um computador. Corte de 10 centímetros quadrados de papel de alumínio e uma fita preta (Figura 1A). Cubra dois quadrantes opostos colando um quadrado de papel alumínio, como primeira camada e fita preta cobrindo-o, tenha cuidado para também cobrir a borda da tampa.
   No passado foram usadas duas formas ligeiramente diferentes desta ensaios. Nós, aqui utilizar o ensaio "quarter-placa", em que a placa de Petri é dividido em quatro partes iguais de ^10. Em alternativa o ensaio de "meia-placa", a placa de Petri é dividido metade (metade exposto à luz, em meia escuro) ^1,7,8. Até hoje não há diferenças significativas entre os dois testes foi publicada.
3. Cola uma folha de quadrante, como a utilizada para a marcação das tampas direito sob a fonte de luz sobre a mesa. Marque a circunferência de uma placa de Petri centrada na intersecção quadrantes. Use as marcas de referência para colocar a placa de teste sempre na mesma posição, sob a fonte de luz.
4. Instale umlâmpada, ou uma simples lâmpada de luz branca (Phillips, Softtone 5W) ou uma lâmpada de LED (lâmpadas LED, 80012 Branco, Osram) acima da placa de Petri com a ajuda de um carrinho suporte de ferro (Fisher Scientific, S47808). Ajustar a altura de uma forma que toda a chapa de teste é iluminado de forma homogénea. Recomendamos o uso de lâmpadas LED, uma vez que emitem comprimentos de onda mais específicas do que as lâmpadas convencionais. Além disso, LEDs emitem menos calor.
5. Ajustar a intensidade da luz com a ajuda de um fotômetro (Ambiente Medidor PCE EM882). Para alcançar a intensidade da luz necessária de 350-760 lux, mover a lâmpada para cima ou para baixo, conforme necessário. Ligar a lâmpada de uma fonte de alimentação ajustável dá mais flexibilidade para mudar as intensidades, sem mover a lâmpada (Figura 1B).

3. Placas de Preparação

1. Adicione 200 ml de 2,5% de agar (Sigma-Aldrich, Suiça A5093-500G), com água bi-destilada (Millipore).
2. Coloque placas de Petri sobre uma mesa (90 mm de diâmetro;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Áustria) em linhas para permitir derramar quente agarose.
3. Ferver a agarose em um forno de microondas até que a solução é completamente transparente e de fluido. Certifique-se de que a solução líquida não contém bolhas. ATENÇÃO: Transporte cuidadosamente a tabela já que a solução pode ser muito quente!
4. Verter a quente de agarose em placas de Petri até que toda a superfície seja homogeneamente coberto com uma fina camada da solução, cerca de dois ou três milímetros são suficientes. Seja rápido para evitar agarose solidificar antes de todas as placas de revestimento. Deixe as placas esfriar. Armazenar as placas à temperatura ambiente, e utilizá-los apenas no mesmo dia da preparação.

4. Luz teste de preferência

1. O trabalho sob condições de luz vermelha na sala de ensaio para evitar a influência de luz antes do ensaio, uma vez Drosophila não é capaz de detectar a luz de comprimentos de onda vermelhos. Use uma lâmpada vermelha (Phillips, PFE712E * 8) montado em uma lâmpada para iluminar tele Place to Work.
2. Manter a temperatura por meio de todas as experiências a 25 ° C. Temperatura ambiente de controle por meio de um dispositivo de aquecimento ou arrefecimento, se necessário.
3. Tome um pouco de comida dos frascos criados para ciclos de dois dias sob constante escuridão (na seção 1). Uma vez que as larvas são geralmente de escavação na superfície da comida, tomar a camada superior (cerca de 5 mm de profundidade) com a ajuda de uma espátula (Fisher Scientific, 14-373-25A). Espalhar a comida no lado exterior de uma tampa da caixa de Petri, adicionar um pouco de água e misturar cuidadosamente com uma espátula.
4. Colete alimentando larvas L3 do alimento. Como preferência luz vai ser testado, escolhendo apenas no início / alimentação das larvas L3 é crucial, pois o phototaxis negativa está garantida. Tarde / vagando larvas L3 ou grande larva rastejando sobre a comida provavelmente já mudaram seu photobehavior. Alimentando larvas L3 (fototáxico negativo) pode ser reconhecida porque seus espiráculos anteriores estão abertas e se projetava para o exterior de forma finger-like. O espiráculo posteriors têm três aberturas de cada um, e quatro grupos de grandes pêlos ramificados. As glândulas salivares estender-se ao segundo segmento abdominal ^11. Estadiamento larva sob um microscópio é conveniente, ao passo que a luz branca não devem ser usados. Uma lâmpada de luz vermelha é necessária para iluminar as larvas se encenar sob microscópio estereoscópico antes dos experimentos é necessária.
5. Lave as larvas brevemente em água corrente e recolher cedo alimentando larvas de terceiro instar (ainda na luz vermelha). Antes de transferir as larvas na placa de teste, tomar as larvas com um pincel molhado e absorver cuidadosamente o excesso de água com uma toalha de papel ou papel-filtro. Não seque as larvas também excessivamente, pois pode prejudicar o animal e influenciar o seu comportamento.
6. Usando o pincel molhado transferir cuidadosamente as larvas de placas. Coloque um grupo de cerca de 30 larvas no centro do prato. Cobrir a placa com a tampa já preparada com os quadrantes e colocou o prato com a fonte de luz pronto para a experiência (ver secção 2).
7. Ligue a lâmpada de luz branca e iniciar o temporizador. Deixe a larva mover-se livremente sobre a placa durante 5 minutos, em seguida, rapidamente remover a tampa e contar o número de larvas no escuro e nos quadrantes de luz. Marcação da posição de cada larva com um marcador pode facilitar a contagem. Alternativamente tirar uma foto da placa e contar a posteriori. Larvas de luz de uma preferência clara, como larvas rastejar nas paredes ou enterrando-ágar devem ser considerados como preferências neutro e apenas ser incluídos no número total de larvas, quando o índice de preferência luz é calculado.
8. Após a contagem, rejeitar a placa com larvas e substitua por uma nova placa de teste para o seguinte experimento. Colete placas usadas em um saco plástico autoclave para o tratamento e despejo posterior.
9. Depois de ter realizado um número suficiente de experimentos de um novo genótipo podem ser testados. 10-15 ensaios por genótipo são suficientes para análise.

5. Dados Analysis

1. Por conveniência transferir os dados para uma folha de dados como o Excel (Microsoft) ou de origem (origem Lab) em um computador para análise estatística. Dispor em uma coluna o número de animais no escuro, numa segunda coluna o número de animais nos quadrantes de luz e no terceiro o total de animais na placa (incluindo larvas "neutro").
2. Calcular o índice de preferência (PREF) para a escuridão para cada experiência com a seguinte fórmula:
   PREF (escuridão) = (número de larvas no escuro - número de larvas na luz) / número total de larvas
3. Comparar estatisticamente um conjunto de dados com uma análise apropriada para grupos. Aqui, usamos um teste de Wilcoxon para comparar estatisticamente dois grupos. Um teste de ANOVA com-comparação múltipla de Tukey post hoc teste pode ser feito, se o pressuposto de distribuição normal é cumprida em uma comparação grupo distribuidor.
4. Adicione gráficos que mostram claramente as comparações entre as linhas e pontos de tempo ao longo do ciclo de dia. We uso do software Origin (Origin Lab) para testar a significância estatística e gerar gráficos apropriados, mas qualquer outro software de estatística pode ser útil.

Resultados

Seguindo o protocolo descrito acima, foi testada preferência claro-escuro no terceiro estádio larvar precoce do tipo selvagem Canton-S opera em dois tempos diferentes e circadianos CT0 CT12. Os adultos foram criados 12 horas de luz de 12 horas escuro e deixou de botar ovos de 12 horas. As larvas crescem os primeiros dois dias no mesmo regime de luz-escuro. Uma vez que nós quisemos testar modulação circadiano em condições constantes (de funcionamento livre do relógio circadiano), as larvas foram então transferid...

Discussão

O teste de preferência light descrito aproveita o photobehavior inata larval. O ensaio é fácil de estabelecer, permite que muitas repetições com baixo custo e oferece informações valiosas sobre detecção de luz e de processamento. O paradigma experimental permite a quantificação relativamente rápido de quantas pessoas preferem clara ou escura. Essa preferência pode ser exibido como percentagens brutas ou, alternativamente, como Índice de Preferência (PREF). O PREF é expressa como a diferença entre os ani...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	A5093-500G	2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland
Petri dishes	Greiner Bio-One GmbH	633180	90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria
LEDs Lamp	OSARAM	80012 White	LED lamp, 80012 White
Environment Meter	PCE	PCE EM882	Lux, Temp, RH%
Thermostatic cabinet	Aqua Lytic (Liebherr)	ET636-6
Light timer	Timer T	6185.104	230V/50HZ (check specifications for your country)
Universal thermostat	Conrad	UT200
Humidifier	Boneco
Balck tape	Tesa		5 cm
Glue	Uhu
lncubator lamp	Phillips	Softtone	5W
Timer clock	Ziliss		Ziliss, Switzerland
Excel Software	Microsoft		Excel
Origin Software 8.5	OriginLab
Backer Yeast	Migros Switzerland
Iron support stand 17X28CM	Fisher Scientific	S47808
Acetic acid	Sigma Aldrich	A6283-100ML	20% acetic acid dilluted in H2O
Red light lamp	Phillips	PFE712E*8C
Spatula	Fisher Scientific	14-373-25A
Power supply	EA	EA PS 2042-06B	Optional
Aluminium foil	Prix Coop
Heater	GOON	NSB200C
Microwave Oven	Intertronic
Standard corn meal fly food
Destilled water