JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويمكن قياس درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي في الخميرة الحية ( S. الخباز) الخلايا باستخدام الأصباغ الفلورية ratiometric مترجمة إلى مقصورات الخلوية محددة. وصفنا إجراءات لقياس درجة الحموضة فجوي مع BCECF-AM، الذي يموضع إلى فجوة في الخميرة، ودرجة الحموضة عصاري خلوي مع ratiometric GFP حساسة للدرجة الحموضة عصاري خلوي (الخميرة pHluorin).

Abstract

فجوي ودرجة الحموضة عصاري خلوي درجة عالية من التنظيم في خلايا الخميرة، وتحتل دورا مركزيا في توازن درجة الحموضة بشكل عام. نحن تصف بروتوكولات لقياس الرقم الهيدروجيني ratiometric في الجسم الحي باستخدام درجة الحموضة حساسة fluorophores مترجمة إلى فجوة أو العصارة الخلوية. يتم قياس درجة الحموضة فجوي باستخدام BCECF، الذي يموضع إلى فجوة في الخميرة عندما أدخلت الخلايا في شكله استر acetoxymethyl. يتم قياس درجة الحموضة عصاري خلوي مع GFP حساسة درجة الحموضة أعرب تحت سيطرة أحد المروجين الخميرة، الخميرة pHluorin. وصفت وسائل لقياس نسب مضان في تعليق خلية الخميرة في مقياس التألق. من خلال هذه البروتوكولات، وقد تم مقارنة وقت واحد نقطة قياسات الحموضة في ظل ظروف مختلفة أو في المسوخ الخميرة مختلفة، ولقد تم رصد تغيرات في درجة الحموضة على مر الزمن. كما تم تكييف هذه الأساليب إلى لوحة مضان قارئ شكل لإجراء التجارب الإنتاجية العالية. مزايا قياس الأس الهيدروجيني pH ratiometric أكثر من AP أخرىموصوفة أيضا مقاربات قيد الاستخدام حاليا، المشاكل المحتملة التجريبية والحلول، وآفاق استخدامها في المستقبل من هذه التقنيات.

Introduction

توازن درجة الحموضة هي عملية ديناميكية ودرجة عالية من التنظيم في جميع الكائنات الحية 1،2. العمليات البيوكيميائية وينظم بإحكام بواسطة الرقم الهيدروجيني، ويتم ضبطها البيئات داخل الخلايا إلى نطاقات ضيقة الرقم الهيدروجيني للسماح النشاط الأمثل للأنزيمات المقيمين. ومع ذلك، الخلايا التوازن درجة الحموضة يمكن الطعن من قبل التغيرات السريعة في درجة الحموضة البيئة، والتحولات الأيضية، وبعض مسارات الإشارات. وبالإضافة إلى ذلك، ودرجة الحموضة داخل الخلايا نفسها يمكن أن تكون بمثابة إشارة هامة. وأخيرا، العديد من العضيات الحفاظ على قيم درجة الحموضة lumenal التي تختلف من العصارة الخلوية المحيطة وأساسية لوظائف عضية محددة.

الخميرة خميرة الخباز أسهم عدد من آليات التوازن درجة الحموضة مع ارتفاع حقيقيات النوى 2. في العضيات الحامضية للمسار التقامي / الليزوزومية، ويتم التحكم في المقام الأول درجة الحموضة من قبل فجوي البروتون translocating أتباز حفظها للغاية (V-أتباز)، تعمل جنبا إلى جنب مع العديد من exchanالخيام تعتمد على التدرج درجة الحموضة. لديهم كل الخلايا حقيقية النواة أيضا آليات التصدير البروتون. في الفطريات والنباتات، والثانية، مضخة البروتون متميزة في غشاء البلازما، Pma1، صادرات البروتونات التمثيل الغذائي، ويعتقد أن يكون محددا رئيسيا من درجة الحموضة عصاري خلوي والمحتملة غشاء البلازما. المرونة الجينية من S. الخباز وأهميتها التجارية، جعلت من نموذج مثيرة جدا للاهتمام ومهم لدراسة توازن درجة الحموضة 2.

بالإضافة إلى كونها السبب الأساسي في عضية تحمض، وV-ATPases درجة عالية من التنظيم الانزيمات، وتهتم مختبرنا في فهم آليات التنظيم V-أتباز. وتحقيقا لهذا الهدف، لقد تم استخدام في قياس الأس الهيدروجيني pH الجسم الحي من درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي: 1) لرصد الاستجابات لتغير الظروف خارج الخلية، مثل الحرمان من الجلوكوز وreaddition، 2) لدراسة آثار الطفرات التي سطا النشاط V-أتباز، و 3) لاستكشاف COORdination من عضية والبلازما مضخات البروتون غشاء 3-5. أصبحت هذه التجارب فقط ممكن من خلال وضع مؤشرات قوية درجة الحموضة ratiometric قابلة للاستخدام في خلايا الخميرة. وأظهرت محطة وآخرون الأولى التي BCECF (2'7'-مكرر (2-carboxyethyl) -5 - (و 6)-carboxyfluorescein).، والتي تم استخدامها على نطاق واسع لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي في خلايا الثدييات، يتراكم في فجوة الخميرة بدلا من العصارة الخلوية 6. ويعزى هذا الاختلاف في BCECF توطين للعديد من الإنزيمات حلمهي في فجوة، والتي من المرجح المسؤولة عن الانقسام من استر الميثيل acetoxy من BCECF-AM (استر acetoxymethyl من BCECF) والاحتفاظ فجوي 6. علي وآخرون. 7 تطويرها قياس درجة الحموضة فجوي باستخدام BCECF وتكييفها هذه القياسات إلى تنسيق قارئ لوحة مضان. بريت وآخرون. عرض pHluorin الخميرة كوسيلة لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي في الخميرة بالإعراب عن R-المنقولة البلازميدatiometric GFP حساسة الرقم الهيدروجيني 8 تحت سيطرة أحد المروجين الخميرة محددة 9.

أطياف الإثارة من كلا BCECF والخميرة pHluorin حساسة لدرجة الحموضة، بحيث يتم استخدامها كمؤشرات درجة الحموضة ratiometric فيه نسبة من مضان على اثنين من موجات الإثارة، ويقاس عند طول موجي واحد الانبعاثات، ويوفر قدرا من درجة الحموضة 8،10. وقد استخدمت هذه المجسات الخميرة درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي لكلا القياسات أحادية الخلية ومرتكزة على السكان. القياسات وحيدة الخلية 6،11 يتم تنفيذها بواسطة الفحص المجهري مضان وتحليل الصور. يتم قياس مضان فجوي أو عصاري خلوي في موجات اثنين لكل خلية. يتم تنفيذ القياسات المأخوذة من السكان في أي قارئ صفيحة ميكروسكوبية مع قدرات مضان المناسبة أو في مقياس التألق. قمنا به عموما قياسات لدينا في مقياس التألق، لأنه يوفر سهولة الوصول لإضافة مكونات مثل الجلوكوز خلال يخدعالقياسات الحركية المستمرين. يتم سرد لدينا بروتوكولات مختبر الحالية لقياس درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي أدناه، ويتم أيضا تكييفها بسهولة على حد سواء لفحوصات صفيحة ميكروسكوبية.

Protocol

1. قياس درجة الحموضة في الجسم الحي باستخدام رغوي BCECF-AM

  1. تنمو ثقافة السائل 50 مل من سلالة الخميرة إلى أن تقاس على المدى المتوسط ​​المطلوب بين عشية وضحاها. الهدف هو أن تكون الخلايا في مرحلة منتصف السجل (OD600 (الكثافة البصرية في 600 نانومتر) قياس ما يقرب من 0.8 لتعليق).
  2. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي الخميرة. Resuspend وبيليه في 0.6 مل من وسط النمو ونقل إلى أنبوب microcentrifuge التي تم وزنه سابقا. بيليه الخلايا مرة أخرى في microcentrifuge في 2،000 x ج لمدة 60 ثانية. إزالة طاف تماما بقدر الإمكان وثم وزن الخلية بيليه. resuspend الكرية إلى كثافة النهائي من 0.5 جم / مل (W / V)، وسوف ثقافة هذا الحجم يعطي الخلية بيليه من حوالي 200 ملغ، و 200 ميكرولتر من العازلة ستضاف إلى إعطاء الحجم النهائي من 400 ميكرولتر.
  3. إضافة BCECF-AM إلى تعليق خلية في تركيز النهائي من 50 مم من الأسهم 12 ملم أعدت في DMSO. تخلط جيدا ثم المؤتمر الوطني العراقيأوباتي الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. على منصة هزاز أو الأسطوانة.
  4. بينما تحتضن الخلايا، وإعداد مخازن المعايرة. المخزن المؤقت معايرة يحتوي على 50 ملي زارة التربية والعلم (2 - (N-morpholino) ethanesulfonic حامض)، 50 HEPES ملم (4 - (2-هيدروكسي إيثيل)-1-piperazineethanesulfonic حامض)، 50 ملي بوكل، 50 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.2 M خلات الأمونيوم، 10 ملي أزيد الصوديوم، و 10 ملي 2-deoxyglucose، ويتم ضبط درجة الحموضة إلى القيم المناسبة لمجموعة معايرة مع هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك. (تنبيه: أزيد الصوديوم شديد السمية، وينبغي التعامل معها بحذر.) لقياس درجة الحموضة في الخلايا من النوع البري، فإننا إعداد عدة مخاليط المعايرة في درجة الحموضة 5،5-6،5، ولكن لالمسوخ المتوقع أن يكون الرقم الهيدروجيني فجوي أكثر قلوية ( المسوخ الأهدل)، ونحن نستعد إضافية، مخازن درجة الحموضة أعلى.
  5. قسامة 2 مل من العازلة معايرة لكل درجة الحموضة في أنابيب مخروطية 15 مل، وإضافة مونينسين (15 ملي الأسهم) وnigericin (الأسهم مم 2) لإعطاء تركيز النهائي من 110 ميكرومتر مونينسين و 15 ميكرومتر nigericin، صespectively. تخلط جيدا في خلاط دوامة. (تنبيه: كل مونينسين وnigericin سامة، وينبغي التعامل معها بحذر.)
  6. عندما يتم الانتهاء من فترة حضانة BCECF-AM، بيليه تعليق خلية بواسطة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 2،000 XG في microcentrifuge. resuspend الخلايا هي 1 مل من متوسط ​​النمو تفتقر الجلوكوز وأجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه. كرر هذه الخطوة يغسل مرة واحدة، ثم resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر من متوسط ​​النمو دون الجلوكوز. مكان على الجليد.
  7. إضافة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل أنبوب معايرة درجة الحموضة أعد أعلاه. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة. على الأسطوانة.
  8. تعيين مقياس التألق لقياس بالتناوب في موجات الإثارة 450 نانومتر و 490 نانومتر، على حد سواء مع الطول الموجي الانبعاثات من 535 نانومتر. ضبط درجة حرارة غرفة العينة إلى 30 درجة مئوية. تنفيذ جميع القياسات مع التقليب المستمر للخليط في كفيت.
  9. إضافة 1.96 مل من 1 ملم MES (تعديلها لدرجة الحموضة 5 أو 7 اعتمادا على درجة الحموضة من نمو الخلايا المتوسطة 'Aالثانية التصميم التجريبي). إضافة 20 ميكرولتر من تعليق خلية في كفيت. بدء قياسات مضان. نقوم بجمع كل البيانات نقطة زمنية في تجارب مختلفة الحركية المستمر و. بالنسبة للبيانات الحركية المستمرة، ونحن نأخذ القياسات كل 6 ثوانى لمدة 5 دقائق، ثم يضاف السكر إلى تركيز الجلوكوز النهائي من 50 ملم، ويستمر لمدة 5-10 دقيقة القياس. لقياسات نقطة زمنية واحدة، ونحن نأخذ القياسات عموما في 1 و 5 دقائق. بعد إضافة الخلايا لكفيت، إضافة الجلوكوز كما في القياسات الحركية، ومن ثم أخذ القياس آخر 5 دقائق. بعد إضافة السكر. يمكن أن تختلف هذه الإضافات، ويمكن أيضا مكونات إضافية (مثبطات، الخ) يمكن ان تضاف.
  10. بعد القياسات التجريبية كاملة، وإزالة أنابيب المعايرة من 30 ° C الحضانة ونقل كامل حجم مل 2 لكل لكفيت مقياس التألق. قياس مضان في نفس الإعدادات (انظر 1.8) كل 5 ثوانى على ما مجموعه 30 ثانية لكل عينة.
  11. تصدير البيانات إلى Microsoft Excel مضان. (للحصول على مقياس التألق لدينا، وهذا يتطلب تصدير البيانات كنص في شكل المفصول والاستيراد إلى Excel.) الحصول على منحنى المعايرة عن طريق حساب نسبة من مضان في 490 نانومتر إلى 450 نانومتر لكل خليط المعايرة. ثم يتم رسم نسبة مضان مقابل الرقم الهيدروجيني للحصول على منحنى المعايرة.
  12. تحويل البيانات التجريبية إلى نسبة مضان وحساب الرقم الهيدروجيني باستخدام منحنى القياسية. يمكن درجة الحموضة فجوي ثم تآمر ضد الزمن (حركية التغييرات درجة الحموضة) أو مقارنة في ظل ظروف مختلفة (الشكل 1) أو في سلالات متحولة مختلفة.

2. قياس درجة الحموضة عصاري خلوي في الجسم الحي باستخدام الخميرة pHluorin

  1. تحويل سلالة الخميرة المطلوب مع pHluorin الخميرة البلازميد بواسطة بروتوكولات موحدة، وحدد ل transformants على استكمال الحد الأدنى المتوسطة تفتقر اليوراسيل (SC-اليوراسيل).
  2. تنمو ثقافة السائل 50 مل من الخلايا تحولت في SC-اليوراسيل إلى مرحلة منتصف السجل (OD 600 = 0.8 أو أقل).
  3. إعداد معايير المعايرة كما هو موضح لدرجة الحموضة فجوي، ولكن المخزن المؤقت لمجموعة ودرجة الحموضة المناسبة لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي، ودرجة الحموضة عموما 6-8. قسامة 2 مل من العازلة معايرة تعديلها لدرجة الحموضة المطلوبة إلى عدة أنابيب مخروطية 15 مل. إضافة مونينسين وnigericin كما هو موضح أعلاه (1.4) وتخلط جيدا.
  4. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه، و resuspend بيليه في 600 ميكرولتر من متوسط ​​النمو. نقل إلى أنبوب microcentrifuge وزنه، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي عند 5،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. Resuspend الكرية في 1 مل من متوسط ​​النمو دون الجلوكوز (SC-اليوراسيل، الجلوكوز)، وخلايا بيليه مرة أخرى وتكرار. بعد الطرد المركزي النهائي، وإزالة طاف على أكمل وجه ممكن، وتزن بيليه الخلية. Resuspend الخلايا إلى كثافة النهائي من 0.5 جم / مل في SC-اليوراسيل مع عدم وجود الجلوكوز.
  5. إضافة 20 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل أنبوب من المخزن المؤقت معايرة وتخلط جيدا في خلاط دوامة. احتضان عند 30 درجة مئوية على الدوار طبلة الغزل لمدة 60 دقيقة.
  6. إعداد مقياس التألق لإثارة عند أطوال موجية 405 و 485 نانومتر والطول الموجي الانبعاثات من 508 نانومتر. المضي قدما في نقطة واحدة مرة أو القياسات الحركية وبالإضافة إلى ذلك من الجلوكوز كما هو موضح أعلاه لقياس BCECF.
  7. قياس مضان من عينات المعايرة، وبناء منحنى المعايرة كما لBCECF (انظر 1،10-1،11). قطعة من نسبة مضان مقابل الرقم الهيدروجيني هو الخطية على نطاق معظم قياسات درجة الحموضة عصاري خلوي (درجة الحموضة 6.0-8.0) 9، وتحويلها بسهولة تجريبية ولذلك قياسات نسبة مضان لدرجة الحموضة.

النتائج

ويبين الشكل 1 البيانات الحموضة فجوي الحصول على خلايا الخميرة البرية من نوع نمت في المتوسط ​​الغني (خلاصة الخميرة، ببتون-ديكستران؛ YEPD) مخزنة لدرجة الحموضة 5 مع 50 ملي زارة التربية والعلم. ونحن غالبا ما تنمو الخلايا في متوسطة مخزنة لأن الرقم الهيدروجيني للمتوس...

Discussion

لقد استخدمت هذه البروتوكولات لمعالجة عدد من جوانب التوازن الرقم الهيدروجيني. على سبيل المثال، لدينا مقارنة الاستجابات عصاري خلوي ودرجة الحموضة من النوع البري وV-أتباز التي تعاني من نقص خلايا متحولة 4،5. لقد درست أيضا آثار تغير ظروف النمو، ودرجة الحموضة خارج الخ...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM50322 R01 لكين PM. الكتاب أشكر الدكتور راجيني راو، جامعة جونز هوبكنز لتوفير الخميرة البلازميدات pHluorin وللحصول على المشورة بشأن قياس الأس الهيدروجيني pH ratiometric، والدكتور غلوريا A. مارتينيز مونيوز على العمل بها هذه البروتوكولات لمختبرنا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
SpectrofluorometerHoriba Jobin YvonModel Fluoromax-4Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AMInvitrogen/Molecular ProbesB1150Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensinSigmaM5273Toxic.
nigericinSigmaN7143Toxic.
MESSigmaM8250

References

  1. Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
  2. Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
  3. Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
  4. Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
  5. Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
  6. Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
  7. Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
  8. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  9. Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
  10. Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
  11. Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
  12. Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
  13. Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
  14. Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
  15. Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
  16. Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
  17. Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
  18. Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
  19. Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
  20. Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

74 ratiometric

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved