Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Вакуоли и цитозольных рН может быть измерена в живых дрожжей ( С. CEREVISIAE) При использовании логометрического флуоресцентных красителей локализованы в конкретных клеточных компартментах. Опишем процедуры измерения рН вакуоли с BCECF-AM, который локализуется в вакуоль у дрожжей и цитозольных рН с цитозольного логометрических рН-чувствительных GFP (дрожжи pHluorin).
Вакуоли и цитозольных рН строго регулируется в клетках дрожжей и занимают центральную роль в гомеостазе общий рН. Мы описываем протоколы для радиометрические измерения рН в естественных условиях использования рН-чувствительных флуорофорам локализован в вакуоль или цитозоль. Вакуоли рН измеряли с использованием BCECF, который локализуется в вакуоль в дрожжах при введении в клетки в ацетоксиметил форме сложного эфира. Цитозольного рН измеряли с помощью рН-чувствительных GFP экспрессировался под контролем промотора, дрожжи, дрожжевой pHluorin. Методы измерения флуоресценции соотношений в дрожжевой клетке суспензий на флуориметре описаны. С помощью этих протоколов, один момент времени измерения рН в разных условиях и в разных мутантов дрожжей сравнением и изменения рН в течение долгого времени был проведен мониторинг. Эти методы также были адаптированы к флуоресцентным планшет-ридере формат высокой пропускной экспериментов. Преимущества радиометрические измерения рН по сравнению с другими APподходы используются в настоящее время, потенциальные экспериментальные проблемы и решения, а также перспективы для будущего использования этих методов также описаны.
рН гомеостаза является динамичной и строго регулируется процесс во всех 1,2 организмов. Биохимические процессы жестко регулируется рН и внутриклеточной среды настроены на узких диапазонах рН для оптимальной деятельности резидента ферментов. Однако гомеостаз внутриклеточного рН может быть оспорена быстрых изменений в рН среды, метаболические сдвиги, и определенные сигнальные пути. Кроме того, внутриклеточный рН сам по себе может служить в качестве важного сигнала. Наконец, многие органеллы поддержания просвета значениях рН, которые отличаются от окружающих цитозоль и необходимым для органелл конкретных функций.
Дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE акций ряда рН гомеостаза механизмов высших эукариот 2. В кислой органелл эндоцитические / лизосомальных пути, рН главным образом управляется высоко консервативны вакуоли протон-АТФазы транслокации (V-АТФазы), действующее совместно с многими валеюрт зависит от рН градиента. Все эукариотической клетки также имеют механизмы протонной экспорт. В грибов и растений, второй, отличный протонного насоса в плазматической мембране, Pma1, экспорт метаболический протонов и, как полагают, основным фактором, определяющим цитозольного рН и потенциала плазматической мембране. Генетической гибкости С. CEREVISIAE и его коммерческой важности, сделали его очень интересной и важной моделью для изучения рН гомеостаза 2.
Помимо того, что главной движущей силой в подкисления органелл, V-АТФазы строго регулируется ферментами и наша лаборатория заинтересован в понимании механизмов V-АТФазы регулирования. Для достижения этой цели мы используем в естественных условиях измерения рН и вакуолярных цитозольные рН: 1) для контроля реакции на меняющийся внеклеточной условия, такие как глюкоза и лишения readdition, 2) для изучения влияния мутаций, что компромисс V-АТФазы, и 3) изучить координатахдинация органелл и плазматической мембраной протонного насоса 3-5. Эти эксперименты только стало возможным благодаря разработке надежных радиометрические показатели рН поддается использовать в клетках дрожжей. . Растений и др. впервые показали, что BCECF (2'7'-бис-(2-карбоксиэтил) -5 - (и 6)-карбоксифлуоресцеина), который широко используется для измерения цитозольного рН в клетках млекопитающих, накапливается в дрожжевой вакуоль вместо цитозоле 6. Это различие в локализации BCECF было обусловлено многими гидролитических ферментов в вакуоль, которые, вероятно, ответственных за отщеплению ацетокси-метиловый эфир из BCECF-AM (ацетоксиметил эфира BCECF) и вакуоли удержания 6. Али и др.. 7 дальнейшее развитие вакуолярных измерения рН с использованием BCECF и адаптировать этих измерений флуоресценции формате ридере. Brett соавт. Введены дрожжи pHluorin в качестве средства измерения цитозольного рН в дрожжах путем экспрессии плазмиды Гatiometric рН-чувствительных 8 GFP под контролем дрожжевого промотора 9.
Спектры возбуждения и BCECF и дрожжей pHluorin чувствительные к рН, поэтому они используются в качестве логометрических показатели рН, в которой отношение флуоресценции при возбуждении двух длинах волн, измеренные при одной длине волны излучения, обеспечивает измерение рН 8,10. Эти дрожжи вакуолярных и цитозольные датчики рН были использованы как для одноклеточных и популяционном уровнях измерений. Одноклеточные измерений 6,11 выполняются с помощью флуоресцентной микроскопии и анализа изображений. Вакуоли или цитозольных флуоресценции при двух длинах волн измеряют для каждой ячейки. Населения на основе измерения выполняются в любом планшетного флуоресценции с соответствующими возможностями или в флуориметра. В целом, мы сделали наши измерения на флуориметре, потому что она обеспечивает легкий доступ для добавления компонентов, таких как глюкоза во Conнепрерывный кинетических измерений. Наши текущие протоколы лаборатории для измерения и вакуолярных цитозольные рН перечислены ниже, оба они являются также легко адаптируется к микропланшет анализов.
1. Измерение рН вакуолярных In Vivo Использование BCECF-AM
2. Измерение цитозольного рН In Vivo Использование дрожжей pHluorin
1 приведены данные вакуоли рН полученных на дрожжей дикого типа клеток, выращенных в обогащенной среде (дрожжевой экстракт-пептон-декстраном; YEPD), забуференном до рН 5 с помощью 50 мМ MES. Мы часто выращивать клетки в буферной среде, поскольку рН среды может резко измениться в тече?...
Мы использовали эти протоколы для решения ряда аспектов рН гомеостаза. Например, мы сравнивали цитозольного и рН реакции дикого типа и V-АТФазы с дефицитом мутантных клеток 4,5. Мы также исследовали влияние изменившихся условий роста, в частности рН внеклеточной, на вакуолярных от?...
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.
Эта работа была поддержана NIH R01 GM50322 в PM Кейна. Авторы благодарят доктора Раджини Рао, Университет Джона Хопкинса за предоставление дрожжей pHluorin плазмид и для рекомендаций по радиометрические измерения рН, и д-р Глория А. Мартинес Муньос для разработки этих протоколов для нашей лаборатории.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
MES | Sigma | M8250 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены