Messung von pH Vacuolar und Cytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; In Hefe Zellsuspensionen

Zusammenfassung

Vacuolar und cytosolischen pH-Wert kann in lebende Hefe gemessen werden ( S. cerevisiae)-Zellen unter Verwendung ratiometrische Fluoreszenzfarbstoffe lokalisiert spezifischen zellulären Kompartimenten. Wir beschreiben Methoden zur Messung des pH-Wertes mit Vakuolen BCECF-AM, die der Vakuole lokalisiert in Hefe und cytosolischen pH mit einer zytosolischen ratiometrische pH-sensitive GFP (Hefe pHluorin).

Zusammenfassung

Vacuolar und cytosolischen pH sind hoch in Hefezellen reguliert und nehmen eine zentrale Rolle in der Gesamtstrategie pH-Homöostase. Wir beschreiben Protokolle für ratiometrischen Messung von pH in vivo mit pH-sensitiven Fluorophoren lokalisiert zur Vakuole oder Cytosol. Vacuolar pH wird unter Verwendung BCECF, die in der Vakuole lokalisiert, wenn sie in Hefe-Zellen in ihrer Acetoxymethylester Form eingeführt. Cytosolischen pH-Wert mit einem pH-sensitive GFP unter Kontrolle eines Hefe-Promotors, Hefe pHluorin ausgedrückt gemessen. Verfahren zur Messung der Fluoreszenz-Verhältnisse in Hefe Zellsuspensionen in einem Fluorimeter beschrieben. Durch diese Protokolle haben einzigen Zeitpunkt Messungen des pH unter verschiedenen Bedingungen oder in verschiedenen Hefe-Mutanten verglichen und Veränderungen im pH im Laufe der Zeit wurden überwacht. Diese Methoden haben auch zu einem Fluoreszenz-Reader-Format für High-Throughput-Experimente angepasst. Vorteile von ratiometrischen pH-Messungen im Vergleich zu anderen apAnsätze derzeit im Einsatz, mögliche experimentelle Probleme und Lösungen und Perspektiven für die zukünftige Verwendung dieser Techniken werden ebenfalls beschrieben.

Einleitung

pH-Homöostase ist ein dynamisches und stark regulierten Prozess in allen Organismen ^1,2. Biochemische Prozesse sind eng durch pH-reguliert und intrazellulären Umgebungen zu engen pH-Bereich abgestimmt, um eine optimale Wirkung der Enzyme Bewohner zu ermöglichen. Allerdings kann intrazelluläre pH-Homöostase durch schnelle Änderungen der Umweltbedingungen pH-, Stoffwechsel-Verschiebungen und bestimmte Signalwege angefochten werden. Darüber hinaus können intrazelluläre pH selbst als ein wichtiges Signal dienen. Schließlich führen viele Organellen luminalen pH-Werten, die sich von der umgebenden Cytosol und wichtig für organellspezifisch Funktionen sind.

Die Hefe Saccharomyces cerevisiae Aktien eine Reihe von pH-Homöostase Mechanismen mit höheren Eukaryoten ^2. In den sauren Organellen der endozytischen / lysosomalen Weg wird vor allem durch den pH-Wert hoch konserviert vacuolar Protonen-Translokation ATPase (V-ATPase) gesteuert wird, in Abstimmung mit den vielen exchangers abhängig vom pH-Gradienten. Alle eukaryotischen Zellen haben auch Protonen-Export-Mechanismen. In Pilzen und Pflanzen, eine zweite, deutlich Protonenpumpenhemmer an der Plasmamembran, PMA1 Exporte metabolische Protonen und ist vermutlich die wichtigste Determinante der cytosolischen pH-und Plasma-Membran Potenzial. Die genetische Flexibilität S. cerevisiae und seine wirtschaftliche Bedeutung, haben es ein sehr interessantes und wichtiges Modell für die Untersuchung pH ² Homöostase.

Abgesehen davon, dass die primären Treiber der Organellen Versauerung, sind V-ATPasen hoch Enzyme reguliert und wird in unserem Labor zu verstehen Mechanismen der V-ATPase Regulierung interessiert. Mit diesem Ziel haben wir in vivo Messungen von pH Vakuole und cytosolischen pH wurde mit: 1), um Antworten auf veränderte extrazelluläre Bedingungen, wie Glukose Deprivation und Neuansatz, 2) zu überwachen, um die Auswirkungen von Mutationen, dass ein Kompromiss V-ATPase-Aktivität zu untersuchen, und 3) zur Erkundung der Koorrung der Organellen und Plasmamembran Protonenpumpen ^3-5. Diese Experimente wurden erst durch die Entwicklung von robusten ratiometrischen pH-Indikatoren zugänglich in Hefezellen nutzen möglich. . Pflanze et al zeigten erstmals, dass BCECF (2'7'-Bis-(2-Carboxyethyl) -5 - (und 6)-Carboxyfluorescein), das verwendet wurde, weitgehend auf cytosolischen pH in Säugetierzellen zu messen, in der Hefe Vakuole akkumuliert anstatt das Cytosol ^6. Dieser Unterschied in der BCECF Lokalisierung hat der vielen hydrolytischen Enzymen in die Vakuole, die geeignet sind, die für die Spaltung der Acetoxy-Methylester aus BCECF-AM (Acetoxymethylester BCECF) und Vakuolen Retention ⁶ zurückgeführt. Ali et al. ⁷ weiterentwickelt vacuolar pH-Messung mit BCECF und angepasst diese Messungen mit einem Fluoreszenz-Reader Format. Brett et al. Eingeführt Hefe pHluorin als Mittel zur Messung der cytosolischen pH in Hefe durch Expression einer Plasmid-borne ratiometric pH-sensitive GFP ⁸ unter der Kontrolle eines Hefe-Promotors ^9.

Die Anregungsspektren sowohl BCECF und Hefe pHluorin sind pH-empfindlich, so dass sie als ratiometrische pH-Indikatoren, wobei das Verhältnis der Fluoreszenz bei zwei Anregungswellenlängen, in einer einzigen Emissionswellenlänge gemessen, ein Maß von pH ^8,10 verwendet. Diese Hefe Vakuole und cytosolischen pH-Sensoren sind sowohl für Single-Cell-und bevölkerungsbezogenen Messungen verwendet worden. Einzel-Zell-Messungen ^6,11 werden durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse durchgeführt. Vacuolar oder cytosolische Fluoreszenz bei den beiden Wellenlängen für jede Zelle gemessen. Die Bevölkerung-basierten Messungen werden entweder in einem Mikroplatten-Reader mit entsprechenden Fluoreszenz-Funktionen oder in einem Fluorimeter durchgeführt. Wir haben unsere Messungen im Allgemeinen in einem Fluorimeter durchgeführt, weil sie einen einfachen Zugang für die Zugabe von Komponenten, wie Glucose während con bietetkontinuierlichen kinetischen Messungen. Unsere aktuellen Labor-Protokolle für die Messung der Vakuole und cytosolischen pH sind unten aufgeführt, beide sind auch leicht zu Mikrotiterplatten-Assays angepasst.

Protokoll

Ein. Messung von pH Vacuolar In Vivo Mit BCECF-AM

1. Grow a 50 ml Flüssigkeit Kultur der Hefestamm in der gewünschten Medium gemessen über Nacht werden. Ziel ist es, Zellen in der mittleren logarithmischen Phase haben (OD600 (optische Dichte bei 600 nm) Messung von ca. 0,8 für die Suspension).
2. Pellet die Hefezellen durch Zentrifugation. Das Pellet in 0,6 ml Wachstumsmedium und Transfer zu einem Mikrozentrifugenröhrchen, die gewogen hat vorher. Pellet die Zellen wieder in einer Mikrozentrifuge bei 2.000 xg für 60 sec. Entfernen Sie den Überstand so vollständig wie möglich und dann wiegen das Zellpellet. Das Pellet auf eine endgültige Dichte von 0,5 g / ml (w / v), einer Kultur dieses Bandes wird ein Zellpellet von etwa 200 mg und 200 ul Puffer geben würde hinzugefügt, um ein Endvolumen von 400 ul zu ergeben.
3. In BCECF-AM zu der Zellsuspension in einer Endkonzentration von 50 mM aus einer 12 mM Stammlösung in DMSO hergestellt. Gut mischen und dann incUbate die Zellen bei 30 ° C für 30 min. auf einem Schaukelstuhl Plattform oder Bandage.
4. Während die Zellen Inkubation, bereiten Kalibrierpuffern. Die Kalibrierung Puffer enthält 50 mM MES (2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure), 50 mM HEPES (4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure), 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 0,2 M Ammoniumacetat, 10 mM Natriumazid und 10 mM 2-deoxyglucose, und ist der pH-eingestellten Werte für Ihre Kalibrierbereich mit NaOH oder HCl. (Vorsicht: Natriumazid ist sehr giftig und sollte mit Sorgfalt behandelt werden.) Für die Messung des pH-Wertes in Wildtyp-Zellen, würden wir mehrere Mischungen Kalibrierung bei pH 5,5 bis 6,5 zubereiten, aber für Mutanten erwartet, dass eine mehr alkalische pH vacuolar haben ( vma-Mutanten), würden wir uns vorbereiten zusätzliche, höhere pH-Puffer.
5. Aliquot 2 ml Puffer Kalibrierung für jede pH in 15 ml konische Röhrchen, und fügen Monensin (15 mM stock) und Nigericin (2 mM Lager), um Endkonzentrationen von 110 pM und 15 pM Monensin Nigericin, r gebenespectively. Mischen Sie gut auf einem Vortex-Mischer. (Achtung: Sowohl Monensin und Nigericin sind giftig und sollten mit Vorsicht behandelt werden.)
6. Wenn die BCECF-AM Inkubationszeit abgeschlossen ist, Pellet die Zellsuspension durch Zentrifugation für 30 sec bei 2.000 xg in einer Mikrozentrifuge. Resuspendieren der Zellen 1 ml Wachstumsmedium Glucose mangelt und zentrifugiert wie oben. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal, und dann das Pellet in 200 ul Wachstumsmedium ohne Glucose. Platz auf dem Eis.
7. In 20 ul der Zellsuspension jedem pH Kalibrierungsröhre oben hergestellt. Inkubation bei 30 ° C für 30-60 min. auf einer Bandage.
8. Stellen Sie die Fluorimeter abwechselnd bei Anregungswellenlängen 450 nm und 490 nm, jeweils mit einer Emissionswellenlänge von 535 nm zu messen. Stellen Sie den Probenraum Temperatur auf 30 ° C. Alle Messungen unter ständigem Rühren der Mischung in die Küvette.
9. In 1,96 ml 1 mM MES (eingestellt auf pH 5 oder 7 in Abhängigkeit vom pH-Wert der Zellen Wachstumsmedium einernd das experimentelle Design). In 20 ul Zellsuspension in der Küvette. Initiieren Fluoreszenzmessungen. Wir sammeln sowohl kontinuierliche kinetische und Zeit-Punkt-Daten in verschiedenen Experimenten. Zur kontinuierlichen kinetischen Daten wir Messungen alle 6 Sekunden für 5 min, dann addieren Glucose zu einer endgültigen Konzentration von Glucose 50 mM und weiterhin Messung für 5-10 min. Für einzelne Zeit-Punkt-Messungen, nehmen wir grundsätzlich Messungen bei 1 und 5 min. nach Zugabe von Zellen in die Küvette, fügen Glucose als in den kinetischen Messungen, und dann eine weitere Messung 5 min. nach Glukose hinaus. Diese Zusätze können variiert werden, und zusätzliche Komponenten (Inhibitoren usw.) können ebenfalls zugegeben werden.
10. Nachdem die experimentellen Messungen abgeschlossen sind, entfernen Sie die Kalibrierung Rohre aus dem 30 ° C Inkubation und übertragen das gesamte Volumen von 2 ml für jede der Fluorimeters Küvette. Messen der Fluoreszenz bei den gleichen Einstellungen (siehe 1.8) alle 5 Sek. über insgesamt 30 sec für jede Probe.
11. Exportieren Fluoreszenz Daten in Microsoft Excel. (Für unsere Fluorimeters erfordert dies den Export von Daten als Text in durch Tabulatoren getrennte Form und Import in Excel.) Gewinne eine Eichkurve, indem das Verhältnis der Fluoreszenz bei 490 nm bis 450 nm für jede Kalibrierung Mischung. Die Fluoreszenz-Verhältnis wird dann gegen pH aufgetragen, um eine Eichkurve zu erhalten.
12. Konvertieren Sie die experimentellen Daten zur Fluoreszenz-Verhältnis und pH berechnen anhand der Standardkurve bestimmt. Vacuolar pH-Wert kann dann gegen die Zeit aufgetragen (Kinetik der pH-Änderungen) oder im Vergleich unter verschiedenen Bedingungen (Abbildung 1) oder in verschiedenen Mutanten.

2. Die Messung der cytosolischen pH In Vivo Mit Hefe pHluorin

1. Verwandeln Sie den gewünschten Hefestamm mit der Hefe pHluorin Plasmid durch Standardprotokolle, und wählen Sie für die Transformanten auf Minimalmedium ergänzt ohne Uracil (SC-Uracil).
2. Grow a 50 ml Flüssigkeit Kultur der transformierten Zellen in SC-Uracil bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD _{600 = 0,8 oder niedriger).}
3. Kalibrierstandards für vacuolar pH, sondern Puffer auf einen pH-Bereich geeignet cytosolischen pH-Messungen, in der Regel pH 6-8 beschrieben. Aliquot 2 ml Puffer Kalibrierung auf den gewünschten pH-Wert in mehrere 15 ml konischen Röhrchen eingestellt. In Monensin und Nigericin wie oben (1.4) beschrieben und gut mischen.
4. Ernten der Zellen durch Zentrifugation wie oben beschrieben, und das Pellet in 600 ul des Wachstumsmediums. Transfer zu einem gewogen Mikrozentrifugenröhrchens und Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 rpm für 30 sec. Resuspendieren des Pellets in 1 ml Wachstumsmedium ohne Glucose (SC-Uracil-glucose), Pellet-Zellen und wiederholen. Nach der letzten Zentrifugation den Überstand so gründlich wie möglich und wiegen das Zellpellet. Die Zellen auf eine endgültige Dichte von 0,5 g / ml in SC-Uracil ohne Glucose.
5. In 20 ul Zellsuspension in jedes Röhrchen der Kalibrierung Puffer und gut mischen auf einem Vortex-Mischer. Inkubation bei 30 ° C auf einer sich drehenden Trommel Rotor für 60 min.
6. Richten Sie die Fluorimeters zur Anregung bei Wellenlängen 405 und 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 508 nm auf. Fahren Sie mit dem einzigen Zeitpunkt oder kinetische Messungen und Zugabe von Glucose, wie oben für BCECF Messung beschrieben.
7. Messen Fluoreszenz Kalibrierproben und kann eine Kalibrationskurve für BCECF (siehe 1,10-1,11). Eine Auftragung der Fluoreszenz gegen pH Verhältnis linear über den Bereich der am cytosolischen pH-Messungen (pH 6,0-8,0) ⁹ sind so experimentellen Fluoreszenzverhältnis einfache Messung pH umgewandelt.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt vacuolar pH Daten auf Wildtyp-Hefezellen in reiche Medium (Hefeextrakt-Pepton-Dextran; YEPD) erhalten, gepuffert auf pH 5 mit 50 mM MES. Oft werden die Zellen in einer gepufferten Medium, weil der pH-Wert des Mediums dramatisch ändern kann während dem Wachstum über Nacht, insbesondere für Minimalmedium, und wir haben festgestellt, dass der pH-Wert des Nährmediums kann sich vacuolar pH ³ Reaktionen. Es ist jedoch auch annehmbar, für viele Experimente, um die Zellen in u...

Diskussion

Wir haben diese Protokolle verwendet, um eine Reihe von Aspekten der pH-Homöostase adressieren. Zum Beispiel haben wir cytosolischen pH und Antworten von Wildtyp-und V-ATPase-defizienten mutierten Zellen ^4,5 verglichen. Wir haben auch die Auswirkungen von Veränderungen der Wachstumsbedingungen, insbesondere extrazellulären pH auf pH vacuolar Reaktion auf Glukose ³ untersucht. Wichtig ist, dass die Antworten, die wir beobachten, sowohl im Einklang mit anderen Methoden der quantitativen pH-Messung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250