La medición de pH vacuolar y citosólica<em&gt; En Vivo</em&gt; En suspensiones de células de levadura

Resumen

PH vacuolar y citosólica se puede medir en la levadura en vivo ( S. cerevisiae) Células usando colorantes fluorescentes ratiometric localizados en compartimentos celulares específicos. Se describen procedimientos para la medición de pH vacuolar con BCECF-AM, que se localiza en la vacuola en levaduras, y el pH citosólico con una GFP sensible al pH radiométrica citosólica (levadura pHluorin).

Resumen

Vacuolar y el pH citosólico están altamente regulados en células de levadura y ocupan un papel central en la homeostasis global de pH. Se describen protocolos para la medición radiométrica de pH in vivo utilizando fluoróforos sensibles al pH localizadas en la vacuola o citosol. PH vacuolar se mide usando BCECF, que se localiza en la vacuola en la levadura cuando se introduce en las células en su forma de éster de acetoximetilo. PH citosólico se mide con una GFP sensible al pH expresado bajo el control de un promotor de levadura, levadura pHluorin. Se describen métodos para la medición de fluorescencia ratios en suspensiones de células de levadura en un fluorímetro. A través de estos protocolos, mediciones puntuales de tiempo individuales de pH bajo condiciones diferentes o en diferentes mutantes de levadura se han comparado y los cambios de pH a través del tiempo han sido controlados. Estos métodos también se han adaptado a un formato de lector de placas de fluorescencia para experimentos de alto rendimiento. Ventajas de las mediciones de pH ratiometric más de otros APTambién se describen los enfoques actualmente en uso, posibles problemas y soluciones experimentales, y las perspectivas para el futuro uso de estas técnicas.

Introducción

la homeostasis del pH es un proceso dinámico y altamente regulado en todos los organismos ^1,2. Los procesos bioquímicos están fuertemente regulados por el pH, y los ambientes intracelulares están sintonizados con rangos estrechos de pH para permitir la óptima actividad de las enzimas residentes. Sin embargo, la homeostasis del pH intracelular puede ser impugnada por los rápidos cambios en el pH del medio ambiente, los cambios metabólicos y algunas vías de señalización. Además, el pH intracelular puede servir por sí misma como una señal importante. Por último, muchos orgánulos mantener los valores pH de la luz que son distintos desde el citosol circundante y esenciales para las funciones específicas de orgánulo.

Los Saccharomyces cerevisiae de levadura acciones un número de mecanismos de homeostasis de pH con eucariotas superiores ^2. En los orgánulos ácidos de la vía endocítica / lisosomal, el pH se controla principalmente por el muy conservadas de protones ATPasa vacuolar translocación (V-ATPasa), en actuación conjunta con muchos intercambiadoresgers dependientes del gradiente de pH. Todas las células eucariotas también tienen mecanismos de exportación de protones. En los hongos y las plantas, un segundo, de la bomba de protones distinto en la membrana plasmática, PMA1, las exportaciones protones metabólicas y se cree que es el principal determinante de pH citosólico y el potencial de la membrana plasmática. La flexibilidad genética de S. cerevisiae y su importancia comercial, se han convertido en un modelo muy interesante e importante para el estudio de la homeostasis del pH ^2.

Además de ser los principales impulsores de la acidificación de orgánulos, V-ATPasas están altamente regulados enzimas y nuestro laboratorio está interesado en comprender los mecanismos de regulación V-ATPasa. Para lograr este objetivo, hemos utilizado en las mediciones de pH in vivo de pH vacuolar y citosólica: 1) para monitorear las respuestas a las cambiantes condiciones extracelulares, tales como la privación de glucosa y readdition, 2) para examinar los efectos de las mutaciones que comprometen la actividad V-ATPasa, y 3) para explorar la coorsobre coordinación de los orgánulos y plasma bombas de protones de membrana ^3-5. Estos experimentos sólo se hizo posible mediante el desarrollo de indicadores de pH ratiometric sólidas susceptibles de utilizar en células de levadura. . Planta et al primero mostró que BCECF (2'7'-bis-(2-carboxietil) -5 - (y 6)-carboxifluoresceína), que se ha utilizado ampliamente para medir el pH citosólico en células de mamífero, se acumula en la vacuola de levadura en lugar de la citosol ^6. Esta diferencia en la localización de BCECF se ha atribuido a las muchas enzimas hidrolíticas en la vacuola, que probablemente responsable de la escisión del éster de metilo acetoxi de BCECF-AM (éster de acetoximetilo de BCECF) y vacuolar de retención ^6. Ali et al. ⁷ desarrollado la medición del pH vacuolar con BCECF y adaptado estas mediciones en un formato de lector de placas de fluorescencia. Brett et al. Introducido pHluorin levadura como un medio de medir el pH citosólico en la levadura mediante la expresión de un plásmido r transmitidasatiometric GFP sensible al pH ⁸ bajo el control de un promotor de levadura-específica ^9.

Los espectros de excitación de ambos BCECF y la levadura pHluorin son sensibles al pH, por lo que se utilizan como indicadores de pH radiométricos en los que la proporción de fluorescencia a dos longitudes de onda de excitación, medidos a una única longitud de onda de emisión, proporciona una medida de pH ^8,10. Estas levaduras sensores de pH vacuolar y citosólica se han utilizado tanto para mediciones de una sola célula y poblacional. Mediciones de celda única ^6,11 se realizan por microscopía de fluorescencia y análisis de imágenes. Fluorescencia vacuolar o citosólica en las dos longitudes de onda se mide para cada célula. Las mediciones basadas en la población se llevan a cabo ya sea en un lector de microplacas con capacidades de fluorescencia apropiados o en un fluorímetro. Hemos hecho generalmente nuestras mediciones en un fluorímetro, ya que proporciona un fácil acceso para la adición de componentes, tales como la glucosa durante el conmediciones cinéticas continuas. Nuestros protocolos de laboratorio actuales para la medición de pH vacuolar y citosólica se enumeran a continuación, ambos también se adaptan fácilmente a los ensayos de microplaca.

Protocolo

1. Medida del pH vacuolar in vivo usando BCECF-AM

1. Crecer un cultivo líquido de 50 ml de la cepa de levadura a medir en el medio deseado durante la noche. El objetivo es que las células en fase semilogarítmica (OD600 (densidad óptica a 600 nm) de medición de aproximadamente 0,8 para la suspensión).
2. Sedimentar las células de levadura mediante centrifugación. Resuspender el precipitado en 0,6 ml de medio de crecimiento y la transferencia a un tubo de microcentrífuga que ha sido previamente pesado. Pellet de nuevo las células en una microcentrífuga a 2000 xg durante 60 seg. Eliminar el sobrenadante tan completamente como sea posible y a continuación, pesar el sedimento celular. Resuspender el pellet a una densidad final de 0,5 g / ml (w / v); una cultura de este volumen dará un sedimento celular de aproximadamente 200 mg, y 200 l de tampón se añadiría para dar un volumen final de 400 l.
3. Añadir BCECF-AM a la suspensión de células a una concentración final de 50 mM de una reserva de 12 mM en DMSO. Mezclar bien y luego incUbaté las células a 30 ° C durante 30 min. en una plataforma oscilante o vibratorios.
4. Mientras que las células están incubando, preparar buffers de calibración. El tampón de calibración contiene 50 mM de MES (2 - (N-morfolino) etanosulfónico), 50 mM HEPES (4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico ácido), 50 mM KCl, 50 mM de NaCl, acetato de amonio 0,2 M, azida de sodio 10 mM, y 10 mM de 2-desoxiglucosa, y se ajusta el pH a valores apropiados para su rango de calibración con NaOH o HCl. (Atención: La azida sódica es altamente tóxica y debe manipularse con cuidado.) Para la medición de pH en las células de tipo salvaje, podríamos preparar varias mezclas de calibración a pH 5,5 a 6,5, pero para los mutantes que se espera que tenga un pH vacuolar más alcalino ( vma mutantes), nos prepare, tampones de pH superiores adicionales.
5. Alícuota de 2 ml de tampón de calibración para cada pH en tubos cónicos de 15 ml, y añadir la monensina (15 mM de existencias) y nigericina (2 mM stock) para dar concentraciones finales de 110 mM monensina y 15 micras, nigericina, respectively. Mezclar bien con un vórtex. (Atención: Tanto monensina y nigericina son tóxicos y deben manejarse con cuidado.)
6. Cuando el tiempo de incubación BCECF-AM se ha completado, la suspensión de células de pellets por centrifugación durante 30 segundos a 2.000 x g en una microcentrífuga. Resuspender las células es 1 ml de medio de crecimiento que carece de glucosa y se centrifuga como anteriormente. Repita este paso de lavado una vez, y luego volver a suspender el precipitado en 200 l de medio de cultivo sin glucosa. Coloque sobre hielo.
7. Añadir 20 l de la suspensión celular a cada tubo de calibración de pH preparado anteriormente. Incubar a 30 ° C durante 30-60 min. en un tambor de rodillos.
8. Ajuste el fluorímetro para medir alternativamente en longitudes de onda de excitación de 450 nm y 490 nm, ambos con una longitud de onda de emisión de 535 nm. Ajuste la temperatura de la cámara de la muestra a 30 ° C. Llevar a cabo todas las mediciones con agitación continua de la mezcla en la cubeta.
9. Añadir 1,96 ml de 1 mM de MES (ajustado a pH 5 o 7 dependiendo del pH del medio de crecimiento de las células de unnd el diseño experimental). Añadir 20 l de suspensión de células en la cubeta. Iniciar las mediciones de fluorescencia. Recopilamos tanto cinética continua y datos de tiempo de punto en diferentes experimentos. Para los datos cinéticos continuos, tomamos mediciones cada 6 segundos durante 5 minutos, a continuación, añadir glucosa a una concentración final de glucosa de 50 mM, y continuar la medición durante 5-10 min. Para las mediciones de tiempo de un solo punto, por lo general, tomamos medidas a 1 y 5 min. después de la adición de las células a la cubeta, añadir la glucosa como en las mediciones cinéticas, y luego tomar otra medición 5 min. después de la adición de glucosa. Estas adiciones pueden ser variados, y también se pueden añadir componentes adicionales (inhibidores, etc).
10. Después de las mediciones experimentales, retire los tubos de calibración de la incubación de 30 ° C y la transferencia de la totalidad del volumen de 2 ml para cada uno a la cubeta fluorímetro. Medir la fluorescencia en la misma configuración (ver 1.8) cada 5 segundos durante un total de 30 segundos para cada muestra.
11. Exportar datos de fluorescencia para Microsoft Excel. (Para nuestro fluorímetro, esto requiere exportación de datos como texto en forma delimitado por tabuladores y la importación en Excel.) Obtener una curva de calibración mediante el cálculo de la proporción de fluorescencia a 490 nm a 450 nm para cada mezcla de calibración. El ratio de fluorescencia se representa gráficamente a continuación, vs pH para obtener una curva de calibración.
12. Convertir los datos experimentales a la proporción de fluorescencia y calcular pH usando la curva estándar. PH vacuolar puede entonces representado frente al tiempo (cinética de los cambios de pH) o en comparación bajo diversas condiciones (Figura 1) o en diferentes cepas mutantes.

2. La medición de pH citosólico En Vivo Con pHluorin levadura

1. Transformación de la cepa de levadura deseada con el plásmido por protocolos estándar de levadura pHluorin, y seleccionar los transformantes en medio mínimo suplementado carece de uracilo (SC-uracilo).
2. Crecer un cultivo líquido de 50 ml de las células transformadas en SC-uracilo a la fase logarítmica media (OD _{600 = 0,8 o inferior).}
3. Preparar los estándares de calibración como se describe para el pH vacuolar, pero tampón a un intervalo de pH apropiado para mediciones de pH citosólicas, generalmente de pH 6-8. Alícuota de 2 ml de tampón de calibración ajusta al pH deseado en varios tubos cónicos de 15 ml. Añadir monensina y nigericina como se describe anteriormente (1.4) y mezclar bien.
4. Recoger las células por centrifugación como se describió anteriormente, y resuspender el sedimento en 600 l de medio de crecimiento. Transferir a un tubo de microcentrífuga de pesado, y precipitar las células por centrifugación a 5000 rpm durante 30 seg. Resuspender el precipitado en 1 ml de medio de crecimiento sin glucosa (SC-uracilo,-glucosa), sedimentar las células de nuevo y repetir. Después de la centrifugación final, eliminar el sobrenadante tan a fondo como sea posible y pesar el sedimento celular. Resuspender las células a una densidad final de 0,5 g / ml en SC-uracilo sin glucosa.
5. Añadir 20 l de suspensión celular a cada tubo de tampón de calibración y mezcle bien en un mezclador de vórtice. Incubar a 30 ° C en un rotor de tambor giratorio durante 60 minutos.
6. Configurar el fluorímetro para la excitación a longitudes de onda 405 y 485 nm y una longitud de onda de emisión de 508 nm. Proceder con el punto sola vez o mediciones cinéticas y la adición de glucosa como se describió anteriormente para la medición de BCECF.
7. Medir la fluorescencia de las muestras de calibración, y la construcción de una curva de calibración como para BCECF (ver 1.10 a 1.11). Una gráfica de la proporción de fluorescencia vs pH es lineal en el rango de la mayoría de las mediciones de pH citosólico (pH 6,0-8,0) ^9, medidas de relación de fluorescencia así experimentales se convierten fácilmente a pH.

Resultados

La Figura 1 presenta los datos de pH vacuolar obtenidos en células de levadura de tipo salvaje cultivadas en medio rico (extracto de levadura-peptona-dextrano; YEPD) tamponada a pH 5 con 50 mM de MES. A menudo crecer las células en medio tamponado debido a que el pH del medio puede cambiar de manera espectacular durante el crecimiento durante la noche, en particular para un medio mínimo, y hemos encontrado que el pH del medio de crecimiento puede afectar a las respuestas de pH vacuolar ^3. ...

Discusión

Hemos utilizado estos protocolos para hacer frente a una serie de aspectos de la homeostasis del pH. Por ejemplo, hemos comparado las respuestas citosólicas y el pH de las células mutantes de tipo salvaje y V-ATPasa deficiente en ^4,5. También hemos examinado los efectos de las condiciones de crecimiento alterado, pH extracelular, particularmente en respuesta a la glucosa pH vacuolar ^3. Es importante destacar que las respuestas que se observan son a la vez coherente con otros métodos de medició...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250