Medição do valor pH vacuolar e Cytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; Em Suspensions célula de levedura

Resumo

PH vacuolar e citosólica pode ser medido em leveduras vivas ( S. cerevisiae) As células utilizando corantes fluorescentes raciométrica localizadas em compartimentos celulares específicos. Nós descrevemos processos de medição de pH vacuolar com BCECF-AM, que se localiza no vacúolo em levedura e pH citosólico com uma GFP sensível ao pH raciométrica citosólica (levedura pHluorin).

Resumo

Vacuolar e pH citosólica são altamente regulamentados em células de levedura e ocupam uma papel central na homeostase do global de pH. Nós descrever protocolos de para a medição de tipo raciométrico de de pH in vivo utilizando fluoróforos-sensíveis ao pH localizadas para o o vacúolo ou citosol. De pH vacuolar é medido usando BCECF, o qual localizes para o vacúolo em levedura quando introduzido em células de, na sua forma éster de acetoximetilo. De pH Cytosolic é medido com um a GFP de pH-sensível expressou ao abrigo o controle de um promotor de levedura, de levedura pHluorin. Métodos para a medição de dos rácios de de fluorescência em suspensões de celulares de leveduras em um fluorímetro são descritos. Através de estes protocolos, as medições de pontos tempo de solteiro de de pH ao abrigo condições diferentes ou em diferentes mutantes de de levedura tenham sido comparados e mudanças no pH ao longo do tempo tenham sido monitorizados. Esses métodos também tiverem sido adaptadas ao um formato de leitor de placas de a fluorescência para a experimentos high-throughput. Vantagens de medições de pH raciométrica mais de outro apdagens atualmente em uso, potenciais problemas de e soluções experimentais, e prospects para uso futuro de estas técnicas também são descritas.

Introdução

a homeostase de pH é uma processo dinâmico e altamente regulamentado em todos os organismos ^1,2. Processos bioquímicos são rigidamente regulada pelo pH, e ambientes de intracelulares estão sintonizados para gamas de pH estreitas para permitir que uma actividade óptima de as enzimas de residentes. No entanto, a homeostase pH intracelular pode ser desafiado por mudanças rápidas na pH ambiental, turnos de metabólicas, e de certas vias de sinalização. Além disso, o pH de intracellular pode em si mesmo servir como um sinal importante. Finalmente, muitas organelas manter os valores de de pH lumenal que são distintas a partir de o citosol circundante e essencial para as funções específicas-organela.

Os de levedura de Saccharomyces partes cerevisiae um certo número de mecanismos de da homeostase de pH com a eucariotas superiores ^2. In as organelas ácidas de o pathway endocytic / lysosomal, pH é controlado, principalmente, pela altamente conservada vacuolar ATPase próton-translocating (V-ATPase), atuando em tandem com muitos exchaniurtas dependentes relativa à gradiente de pH. Todos os células eucarióticas também têm mecanismos de exportação de prótons. In é acreditado fungos e plantas, uma segunda da bomba de próton, distinto na membrana plasma, Pma1, as exportações prótons metabólicas e para ser o dos principais determinantes da pH citosólica e potencial de membrana plasma. A flexibilidade genética de S. cerevisiae e sua importância comercial, fizeram-lhe um modelo de muito interessante e importante para o estudo de a homeostase pH ^2.

In Além de ser os drivers de primárias de organelle a acidificação, V-ATPases são altamente regulamentados enzimas e nosso laboratório de está interessado em compreender mecanismos de regulação V-ATPase. Rumo a este objetivo, temos vindo a utilizar em medições de pH in vivo de pH vacuolar e citosólica: 1) para monitorar respostas aos mudanças nas condições de extracelulares, tais como privação glicose e readdition, 2 de) para examinar os efeitos de mutações que compromisso de atividade V-ATPase, e 3) para explorar a coordenação de organelle e plasma de membrana bombas de protões ^3-5. Estes experimentos só se tornou possível através de o desenvolvimento de robustas indicadores de pH raciométrica passíveis da para usar em células de levedura. . Vegetal et ai mostrou pela primeira vez de que BCECF (2'7'-Bis-(2-carboxietilo) -5 - (e 6 de)-carboxif luoresceina), o qual tem sido utilizado amplamente para medir o pH citosólica em células de mamíferos, se acumula em o vacúolo de levedura em vez de o citosol ^6. Esta diferença na BCECF localisation tem sido atribuída a as muitas enzimas hidrolíticas em o vacúolo, os quais são provável responsável pela clivagem do o éster de meti Io acetoxi a partir de BCECF-Rádio AM (éster acetoximetilo de BCECF) e retenção de vacuolar ^6. Ali et ai. ⁷ ainda mais desenvolvido pela medição do pH vacuolar usando BCECF e adaptado estas medições para um formato de leitor de placas de de fluorescência. De Brett et ai. Apresentar-pHluorin de levedura como um meio de de medição de pH citosólica em levedura por expressar os um r r plasmídeo de-borneatiometric a GFP de pH-sensível ^8, sob controlo de um promotor específico-levedura ^9.

O Os espectros de de excitação de tanto BCECF e levedura de cerveja pHluorin são sensíveis-se até pH, assim, elas são usados ​​como indicadores de pH raciométrica na qual o rácio de de de fluorescência a dois comprimentos de onda de excitação, medidos em condições um único comprimento de onda de emissão de, e que providencia uma medida de de pH ^8,10. Estes sensores de pH vacuolares e citosólica levedura têm sido utilizados para ambas as medições single-cell and-baseada em população. Medições de-de células Um único ^6,11 são executadas por microscopia de de fluorescência e de análise de imagem. De fluorescência vacuolar ou citosólica aqui as dois comprimentos de onda é medido para as cada célula. As medições-baseados em população são efectuado tanto na um leitor de microplacas de com capacidades de de fluorescência adequadas ou o em um f luorimetro. Nós têm, em geral feito os nossos de medições sobre uma fluorímetro, com um porque ele fornece do fácil acesso para adição de componentes, tais como glucose durante engodomedições de cinéticos contínuo. Nossos protocolos de actuais do laboratório para a medição de de de pH vacuolar e citosólica são coletados abaixo; ambos também são facilmente adaptados-se a ensaios de microplacas.

Protocolo

1. Medição do valor pH vacuolar Em a Vivo Usando BCECF-Rádio AM

1. Cresça um de 50 ml de cultura líquido de o estirpe de levedura para ser medido em a médio o desejar o pernoite. A meta é para têm células de em fase de meados-de log (DO600 (densidade óptica a 600 de nm) à mensuração dos aproximadamente, de 0,8 para a suspensão).
2. Da pelota as células de levedura, por centrifugação em. Ressuspender o o pellet em 0,6 ml de o meio de crescimento e transferência para um tubo de microcentrífuga de que tenha sido, previamente tarado com. De pellets as células novamente em um de microcentrífuga de a 2.000 xg por 60 sec. Remover filtro-se o sobrenadante, tão completamente quanto possível e em seguida, pesam o pellet célula. Ressuspender o pelete até uma densidade final de 0,5 de g / ml de (w / v) de; uma cultura de este volume irá dar um pelete de células de, aproximadamente, de 200 mg, e 200 jil de tampão de iria ser adicionado a dar um volume final de de 400 uL.
3. Adicionar BCECF-AM às o suspensão celular a uma operação de concentração final de 50 mM de a partir de um Estoque 12 de mM de preparado no seio de DMSO. Misture bem e, em seguida, incUbate as células em 30 de ° C durante de automóvel 30 min. em uma plataforma de de balanço ou o tambor de rolete.
4. Enquanto as células de estiverem incubando, prepare-se buffers de de calibração. O buffer de de calibração contém 50 mM de MES (2 - (N-morf olino) Solução de ácido etanossulfónico), a 50 mM de HEPES (4 - (2-de hidroxietilo)-1-piperazinoetanossulfónico ácido), de KCl equivalentes a 50 mM, NaCI a 50 mM, do acetato de de amónio 0,2 M, 10 azida de mM de sódio, e 10 mM 2-deoxyglucose, e é ajustado para o pH valoriza apropriado para o seu faixa de calibração com NaOH ou HCl. (Cuidado: A azida de Sódio é altamente tóxico, e deverá ser manuseado com cuidado.) Para a medição da de de pH em células de-Tipo de deixa selvagens, nós iria preparar vários misturas de calibração a pH 5,5 a 6,5, mas para os mutantes prevê venham a ter um pH vacuolar obter mais alcalina (de mutants vma), nós iria preparar buffers de pH adicionais, mais elevados.
5. Aliquotar de 2 ml de tampão de de calibração para cada valor de pH em 15 ml tubos cónicos de, e de adicioná monensina na dieta (Estoque 15 de mM) e nigericina (Estoque 2 mM de) para dar origem concentrações finais de 110 | iM monensina de e 15 º uM nigericina, r respectively. Misture bem on um misturador de vórtice. (Caution: Both monensina e nigericina são tóxicos e deve ser manuseado com cuidado.)
6. Quando o tempo de incubação BCECF-Rádio AM é concluída, peletizar a suspensão de células por centrifugação durante 30 de seg Rácio às 2,000 xg, em um de microcentrífuga de. Ressuspender as células é de 1 ml de meio de crescimento carente de glicose e centrifuga-se como acima. Repita este passo de lavagem com uma vez, e, em seguida, fim de ressuspender a sedimento em 200 jil de meio de crescimento sem glicose. Lugar on de gelo.
7. Juntar 20 ul de a suspensão de células a cada tubo de de calibração de pH preparado acima. Incubar a uma temperatura 30 de ° C durante 30-60 mín. sobre um tambor rolete.
8. Defina o fluorímetro para medir alternadamente em comprimentos de onda de excitação 450 nm e 490 nM, ambos os com um comprimento de onda de emissão de de 535 nm. Defina a temperatura do câmara de amostra para de 30 ° C. Perform todas as medições de, com agitação contínuas de-se a mistura na cuvete de.
9. Adicionar 1,96 ml de do EEM dentro em 1 mM de (ajustado-se até pH 5 ou 7, dependendo da o pH de meio de crescimento as 'células que umand o design experimental). Juntar 20 jil de suspensão de células na cuvete de. Initiate medições de fluorescência. Nós coletamos tanto kinetic contínua e de dados em tempo-ponto em diferentes experimentos. Para obter dados cinéticos contínuas, nós tomamos medições a cada 6 seg Rácio para de automóvel 5 min,, em seguida, de adicioná glicose para uma operação de concentração definitivo de glicose de 50 mM de, e continuar medição de durante 5-10 min. Para medições de solteiras time-de ponto, nós geralmente efectuar medições em 1 e 5 min. depois de adição de células ao o cuvete, as de adicioná a glicose como em as medições cinéticos, e outra em seguida, tomar-se outra medição de automóvel 5 min. após a adição da glucose. Estas adições pode ser variada, e de componentes do adicionais de (inibidores da, etc) também pode ser adicionado.
10. Depois que os medições experimentais são concluída, remova os tubos de de calibração a partir de o 30 ° C de incubação e transferir toda a ml volume de 2 para cada um para o cuvette fluorímetro. Meça fluorescência em as mesmas configurações de (ver 1.8) a cada 5 sec ao longo de um total de 30 de sec para cada amostra.
11. Exportar dados de fluorescência para Microsoft Excel. (Para o nosso fluorímetro, isto requer exportação de dados como texto em forma de tab-delimited e importação para Excel.) Obter um curva de calibração por meio do cálculo a proporção de de fluorescência a 490 nm para 450 nm para cada mistura de calibração. O rácio de fluorescência é, em seguida, plotados vs de pH para obter um curva de calibração.
12. Converta os dados de experimentais para rácio de de fluorescência e calcular do pH utilizando um a curva padrão. De pH vacuolar pode, em seguida, plotados contra o tempo (cinética da sua as alterações de pH) ou comparado ao abrigo diferentes condições (Figura 1) ou em diferentes estirpes mutantes.

2. Medição do valor pH Cytosolic Em a Vivo Usando pHluorin Levedura

1. Transform o estirpe de levedura o desejar com o pHluorin plasmídeo de levedura por protocolos de forfetários, e selecionar para transf ormantes sobre suplementado meio mínimo de uracilo faltando (em SC-de uracil),.
2. Cresça um de 50 ml de cultura líquido de células transformadas especialmente em SC-de uracilo até à fase meados-de log (Posição OD _{600 = 0,8 ou inferior)-.}
3. Prepare a padrões de calibração de como se descreveu para de pH vacuolar, mas buffer para uma gama de pH apropriado para as medições de pH citosólicas, geralmente de pH 6-8. Aliquotar de 2 ml de tampão de de calibração ajustado para o pH o desejar em várias de 15 ml tubos cónicos de. Adicionar monensina e do nigericina tal como descrito de cima (1,4) e nos misture bem.
4. Colha as células por centrifugação, tal como descrito, supra, e fim de ressuspender o sedimento em 600 ul de o meio de crescimento. Transfira para uma tubo de microcentrífuga de pesava, e as células da pelota por centrifugação a 5.000 rpm durante 30 de seg Rácio. Ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de crescimento sem glicose (apenas SC-uracilo, cloridrato de-glucose), as células da pelota novamente e repita os. Depois que o centrifugação final, retire-se o sobrenadante tão completamente quanto possível e pesar o pelete célula. Ressuspender com células até uma densidade final de 0,5 de g / ml de em SC-de uracilo com nenhuma da glucose.
5. Juntar 20 jil de suspensão celular aos cada tubo de de tampão de de calibração e misture bem sobre um mixador de de vórtice. Incubar a 30 ° C num rotor de tambor giratório durante 60 minutos.
6. Configure o fluorímetro para a excitação em comprimentos de onda 405 e 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 508 nm. Prosseguir com um único ponto de tempo ou medições cinéticas e adição de glicose como acima descrito para a medição de BCECF.
7. Medir a fluorescência das amostras de calibração e construir uma curva de calibração como para BCECF (veja 1,10-1,11). A trama da relação de fluorescência versus pH é linear em toda a gama da maioria das medições de pH citosólicas (pH 6,0-8,0) ^9, as medições relação fluorescência tão experimentais são facilmente convertidos em pH.

Resultados

A Figura 1 apresenta os dados de pH vacuolar obtidos em células de levedura de tipo selvagem cultivadas em meio rico (extracto de levedura-peptona-dextrano; YEPD), tamponadas a pH 5 com 50 mM de MES. Frequentemente crescer as células em meio tamponado, porque o pH do meio pode mudar dramaticamente durante o crescimento durante a noite, em especial para um meio mínimo, e verificou-se que o pH do meio de crescimento pode afectar as respostas do pH vacuolar ^3. No entanto, também é aceitáve...

Discussão

Nós utilizamos esses protocolos para abordar uma série de aspectos da homeostase do pH. Por exemplo, nós compararam respostas citosólicas e pH de células mutantes do tipo selvagem e V-ATPase deficiente ^4,5. Examinamos, também, os efeitos das condições de crescimento alterados, pH particularmente extracelular, em resposta pH vacuolar de glicose ^3. É importante ressaltar que as respostas que observamos são consistentes com outros métodos de medição de pH quantitativa e com dados bioquím...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250