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摘要

可以测量活酵母液泡膜和细胞内pH值( S。酵母)定位到特定的细胞区室的使用比例荧光染料的细胞。我们描述BCECF-AM,定位于液泡酵母,细胞内pH值与胞浆的比例的pH敏感GFP(酵母pHluorin所指示)测量空泡pH值的程序。

摘要

在酵母细胞中液泡和胞质pH值受到高度监管和整体pH值稳态占据了核心作用。我们描述了协议的比例测量pH值在体内使用pH敏感的荧光团本地化液泡或细胞质。 BCECF,乙酰甲酯形式导入细胞时,它定位在酵母液泡液泡pH值是衡量使用。细胞质pH值的测量是对pH敏感的绿色荧光蛋白表达的酵母启动子的控制下,酵母pHluorin所指示。在荧光计中的酵母细胞悬浮液的荧光比的测量方法进行说明。通过这些协议,单一时间点的pH值测量不同条件下或在不同的酵母突变体进行了比较,并已监测pH值的变化随着时间的推移。这些方法也适合于高通量实验的荧光板读数器的格式。比例比其他AP的pH测量的优点接近目前的用途,潜在实验的问题和解决方案,以备将来使用这些技术的前景也有所说明。

引言

pH值的平衡是一个充满活力和高度调节的过程中,在所有的生物1,2。生化过程严格监管的pH值,细胞内环境的调整,以使优化常住酶的活性狭窄的pH值范围。然而,细胞内pH稳态可以挑战的快速变化环境的pH值,代谢变化,以及某些信号传导通路。此外,细胞内pH值本身可以作为一个重要的信号。最后,许多细胞器保持腔的pH值是不同于周围的胞质溶胶和必需的细胞器的特定功能。

酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)股数与高等真核生物2的pH的体内平衡机制。酸性细胞内吞/溶酶体途径,pH值主要控制高度保守的空泡质子转运ATP酶(V-ATP酶),随许多EXCHAN蒙古包依赖于pH梯度。所有真核细胞中也有质子出口机制。在真菌和植物,在质膜上的第二,不同的质子泵,PMA1,出口代谢质子和被认为是细胞内pH值和细胞膜电位的主要决定因素。 S.遗传灵活性酵母和其商业上的重要性,提出了一个非常有趣和重要的研究pH值稳态模型2。

除了细胞器酸化的主要驱动,V-ATP酶被高度管制的酶和我们实验室的兴趣了解V-ATPase的调节机制。为了实现这一目标,我们一直在使用液泡和胞质pH值在体内 pH值的测量:1)监测反应改变外条件,如葡萄糖的剥夺和readdition,2)审查突变,妥协V-ATPase活性的影响, 3)探索COORdination细胞器和质膜质子泵3-5。这些实验通过强劲的比例适合于使用在酵母细胞中的pH值指标的发展才成为可能。厂房等人首先表明,BCECF(2'7'-二(2 -羧基乙基)-5 - (6) -羧基荧光素),它已被广泛应用,以测量细胞内pH值在哺乳动物细胞中,积聚在酵母液泡而不是在细胞质6。这种差异在BCECF本地化已被归因于液泡中的水解酶,这是有可能负责裂解乙酰氧甲基酯BCECF-AM(乙酰氧基甲基酯,BCECF)和液泡保留6。阿里等人进一步开发的液泡pH测量使用BCECF,适应这些测量荧光酶标仪格式。布莱特等人介绍了酵母pHluorin所指示由表达质粒源性ŗ的在酵母细胞内pH值的测定作为一种手段pH敏感的绿色荧光蛋白atiometric 8酵母特异性启动子的控制下9。

BCECF酵母pHluorin所指示的激发光谱是对pH敏感的,因此它们被用作比例的pH值如下:两个激发波长,在一个单一的发射波长测量,荧光的比例提供了一个衡量的pH为8,10。这些酵母液泡和胞质pH传感器已用于单细胞和人口为基础的测量。 6,11测量单细胞进行荧光显微镜和图像分析。液泡膜或胞浆上​​面的两个波长的荧光的测量为每个小区。人口为基础的测量进行适当的荧光功能酶标仪或荧光计中。我们通常是在荧光计测量,因为它提供了方便添加组件,如葡萄糖在con连续动力学测量。下面列出我们目前实验室协议液泡和胞质pH值的测量,二者也容易适应微孔板检测。

研究方案

1。 BCECF-AM 在体内使用液泡pH值测量

  1. 长出一个50毫升的液体培养过夜所需的媒体要被测量的酵母菌株。我们的目标是有细胞数中期(OD值(在600nm处的光密度)为约0.8的悬浮液中的测量)。
  2. 颗粒通过离心分离酵母细胞。悬浮颗粒0.6毫升培养基中生长和转移到已称重的离心管。颗粒细胞再次离心2,000 XG,持续60秒。尽可能完全去除上清,然后权衡细胞沉淀。重悬沉淀至最终密度为0.5克/毫升(重量/体积),将被添加到本卷文化将得到约200毫克的细胞沉淀,加入200μl缓冲液使最终体积为400μl。
  3. 添加BCECF-AM的细胞悬浮液从12毫米的股票,在DMSO中制备终浓度为50mM的。拌匀,然后公司ubate细胞在30℃下30分钟。在摇摆平台或辊筒。
  4. 虽然细胞培育,准备校准缓冲区。校准的缓冲液含有50mM的MES(2 - (N-吗啉代)乙磺酸),50mM的HEPES(4 - (2 - 羟基乙基)-1 - 哌嗪乙磺酸),50mM的氯化钾,氯化钠的50mM乙酸铵,0.2M,的10mM叠氮化钠,10mM的2 - 脱氧葡萄糖,并已被调整,以将pH值适当的校准范围内,用NaOH或HCl。 (注意:叠氮化钠是剧毒,应小心处理。)在野生型细胞中的pH值的测量,我们会准备几个校准混合物在pH值5.5至6.5,但预计将有更碱性空泡,pH值的突变体( VMA突变),我们会准备更多,更高的pH缓冲液。
  5. 各pH校准缓冲分装2毫升到15毫升锥形管,并添加莫能菌素(15毫米的股票)和尼日利亚菌素(2毫股票)给最终浓度莫能110微米和15微米尼日利亚菌素,Respectively。拌匀的旋涡混合器。 (注意:莫能菌素,尼日利亚菌素是有毒的,应谨慎处理。)
  6. 当BCECF-AM孵育时间完成后,沉淀细胞悬浮液通过离心分离,持续30秒,在2000×g离心微量离心。重悬细胞为1毫升生长培养基中缺乏葡萄糖和离心机如上。重复该洗涤步骤一次,然后将沉淀重悬于200微升生长培养基中不含葡萄糖。置于冰上。
  7. 的细胞悬浮液中加入20μl上述制备的各pH校正管。在30°C孵育30-60分钟。辊式转鼓上。
  8. 设置的荧光计,交替测量在激发波长450纳米和490纳米的发光波长为535 nm。样品室的温度设定至30℃。在连续搅拌下将混合物在比色皿中执行的所有测量。
  9. 加入1.96毫升1 mM的MES(调整至pH为5或7的pH值取决于细胞的生长培养基中的一个ND实验设计)。到试管中,加入20μl的细胞悬液。启动荧光测量。我们同时收集连续的动能和时间点在不同的实验数据。对于连续的动力学数据,每6秒测量5分钟,然后添加葡萄糖至最终的50mM的葡萄糖浓度,并继续测量5-10分钟。对于单一时间点的测量,我们一般采取的测量在1和5分钟。加入比色皿的细胞后,添加葡萄糖在动力学测量,然后进行下一次测量5分钟。后加入葡萄糖。这些增加的可以是多种多样的,并且,也可以添加额外的组件(抑制剂等)。
  10. 实验测量完成后,取出校准管从30°C孵育,整个2毫升的量为每次转移的荧光计比色皿。荧光测量在相同的设置(见1.8),每隔5秒,共30秒以上,每个样品。
  11. 荧光数据导出到Microsoft Excel。 (对于我们的荧光计,这要求出口数据作为制表符分隔的形式导入到Excel中的文本。)获得校准曲线计算荧光的比例在490纳米至450纳米每个校准混合物。的荧光的比率,然后与pH值的关系作图得到的校准曲线。
  12. 实验数据转换荧光比使用标准曲线计算pH值。液泡膜的pH值,然后随时间(动力学的pH值的变化),或者在各种条件下( 图1),或在不同的突变株相比。

2。 在体内使用酵母pHluorin所指示胞内pH值的测量

  1. 变换pHluorin所指示质粒标准协议与酵母所需的酵母菌株,并选择补充基本培养基缺乏尿嘧啶(SC-尿嘧啶)的转化。
  2. SC-尿嘧啶转化细胞长出了50毫升液体培养数中期(OD 的600 = 0.8或更低)。
  3. 准备校准标准所描述的液泡中的pH值,但缓冲区适当的pH值范围为胞质pH测量,一般pH值6-8。等分试样2毫升校准缓冲液调节到所需的pH值到15毫升锥形管的一些。添加莫能菌素,尼日利亚菌素(1.4)如上所述,拌匀。
  4. 如上所述通过离心收集细胞,将沉淀重悬于600微升生长培养基中。转移至称量微量离心管中,沉淀细胞,在5,000 rpm离心30秒。将沉淀重悬于1毫升生长培养基中没有葡萄糖(SC-尿嘧啶,葡萄糖),再次沉淀细胞,并重复。最后离心后,除去上清液尽可能彻底和权衡细胞沉淀。重悬细胞至最终密度为0.5克/毫升的SC-尿嘧啶没有葡萄糖。
  5. 加入20μl的细胞悬液,每管校准缓冲的旋涡混合器拌匀。孵育30℃60分钟,一个旋转的鼓形转子。
  6. 设置为在波长405和485nm的激发和发射波长为508 nm的荧光计。继续进行,单一的时间点或动力学测量和BCECF测量上述用于添加葡萄糖。
  7. 测量荧光校准样品,并构建BCECF(1.10-1.11)的校准曲线。 A地块的荧光比与pH值线性范围最胞质pH值测量值(PH值6.0-8.0)9,实验很容易转换荧光比率测量pH值。

结果

图1给出营养丰富的培养基中生长的野生型酵母细胞(酵母提取物,蛋白胨-葡聚糖YEPD)与50毫米的MES缓冲pH值至5液泡pH值获得的数据。我们经常在缓冲介质中生长的细胞,因为培养基的pH变化相当显着的期间,特别是对基本培养基中生长过夜,我们已经发现,生长培养基的pH值可能会影响液泡pH值的反应3。然而,也可以接受多次实验,在非缓冲培养基中生长的细胞。 图1A<...

讨论

我们利用这些协议处理若干方面的pH稳态。例如,我们已经比较4,5野生型和V-ATP酶缺陷的突变细胞的细胞质和pH响应。我们还研究改变生长条件,尤其是细胞外pH值,葡萄糖3液泡pH响应的影响。重要的是,我们观察到的响应都与其它方法定量的pH测量和一致的生化数据,描述改变质子泵活动。

这里所描述的两个最重要的功能不同的体内 pH测量的荧光基团的...

披露声明

作者有没有利益冲突的披露。

致谢

这项工作是由美国国立卫生研究院R01 GM50322支持到PM凯恩。作者感谢pHluorin所指示的酵母质粒和建议比例pH值测量的约翰斯·霍普金斯大学博士饶Rajini,,凯莱博士A.马丁内斯·穆尼奥斯这些协议,我们的实验室工作。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
SpectrofluorometerHoriba Jobin YvonModel Fluoromax-4Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AMInvitrogen/Molecular ProbesB1150Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensinSigmaM5273Toxic.
nigericinSigmaN7143Toxic.
MESSigmaM8250

参考文献

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