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Method Article
可以测量活酵母液泡膜和细胞内pH值( S。酵母)定位到特定的细胞区室的使用比例荧光染料的细胞。我们描述BCECF-AM,定位于液泡酵母,细胞内pH值与胞浆的比例的pH敏感GFP(酵母pHluorin所指示)测量空泡pH值的程序。
在酵母细胞中液泡和胞质pH值受到高度监管和整体pH值稳态占据了核心作用。我们描述了协议的比例测量pH值在体内使用pH敏感的荧光团本地化液泡或细胞质。 BCECF,乙酰甲酯形式导入细胞时,它定位在酵母液泡液泡pH值是衡量使用。细胞质pH值的测量是对pH敏感的绿色荧光蛋白表达的酵母启动子的控制下,酵母pHluorin所指示。在荧光计中的酵母细胞悬浮液的荧光比的测量方法进行说明。通过这些协议,单一时间点的pH值测量不同条件下或在不同的酵母突变体进行了比较,并已监测pH值的变化随着时间的推移。这些方法也适合于高通量实验的荧光板读数器的格式。比例比其他AP的pH测量的优点接近目前的用途,潜在实验的问题和解决方案,以备将来使用这些技术的前景也有所说明。
pH值的平衡是一个充满活力和高度调节的过程中,在所有的生物1,2。生化过程严格监管的pH值,细胞内环境的调整,以使优化常住酶的活性狭窄的pH值范围。然而,细胞内pH稳态可以挑战的快速变化环境的pH值,代谢变化,以及某些信号传导通路。此外,细胞内pH值本身可以作为一个重要的信号。最后,许多细胞器保持腔的pH值是不同于周围的胞质溶胶和必需的细胞器的特定功能。
酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)股数与高等真核生物2的pH的体内平衡机制。酸性细胞内吞/溶酶体途径,pH值主要控制高度保守的空泡质子转运ATP酶(V-ATP酶),随许多EXCHAN蒙古包依赖于pH梯度。所有真核细胞中也有质子出口机制。在真菌和植物,在质膜上的第二,不同的质子泵,PMA1,出口代谢质子和被认为是细胞内pH值和细胞膜电位的主要决定因素。 S.遗传灵活性酵母和其商业上的重要性,提出了一个非常有趣和重要的研究pH值稳态模型2。
除了细胞器酸化的主要驱动,V-ATP酶被高度管制的酶和我们实验室的兴趣了解V-ATPase的调节机制。为了实现这一目标,我们一直在使用液泡和胞质pH值在体内 pH值的测量:1)监测反应改变外条件,如葡萄糖的剥夺和readdition,2)审查突变,妥协V-ATPase活性的影响, 3)探索COORdination细胞器和质膜质子泵3-5。这些实验通过强劲的比例适合于使用在酵母细胞中的pH值指标的发展才成为可能。厂房等人首先表明,BCECF(2'7'-二(2 -羧基乙基)-5 - (6) -羧基荧光素),它已被广泛应用,以测量细胞内pH值在哺乳动物细胞中,积聚在酵母液泡而不是在细胞质6。这种差异在BCECF本地化已被归因于液泡中的水解酶,这是有可能负责裂解乙酰氧甲基酯BCECF-AM(乙酰氧基甲基酯,BCECF)和液泡保留6。阿里等人进一步开发的液泡pH测量使用BCECF,适应这些测量荧光酶标仪格式。布莱特等人介绍了酵母pHluorin所指示由表达质粒源性ŗ的在酵母细胞内pH值的测定作为一种手段pH敏感的绿色荧光蛋白atiometric 8酵母特异性启动子的控制下9。
BCECF酵母pHluorin所指示的激发光谱是对pH敏感的,因此它们被用作比例的pH值如下:两个激发波长,在一个单一的发射波长测量,荧光的比例提供了一个衡量的pH为8,10。这些酵母液泡和胞质pH传感器已用于单细胞和人口为基础的测量。 6,11测量单细胞进行荧光显微镜和图像分析。液泡膜或胞浆上面的两个波长的荧光的测量为每个小区。人口为基础的测量进行适当的荧光功能酶标仪或荧光计中。我们通常是在荧光计测量,因为它提供了方便添加组件,如葡萄糖在con连续动力学测量。下面列出我们目前实验室协议液泡和胞质pH值的测量,二者也容易适应微孔板检测。
1。 BCECF-AM 在体内使用液泡pH值测量
2。 在体内使用酵母pHluorin所指示胞内pH值的测量
图1给出营养丰富的培养基中生长的野生型酵母细胞(酵母提取物,蛋白胨-葡聚糖YEPD)与50毫米的MES缓冲pH值至5液泡pH值获得的数据。我们经常在缓冲介质中生长的细胞,因为培养基的pH变化相当显着的期间,特别是对基本培养基中生长过夜,我们已经发现,生长培养基的pH值可能会影响液泡pH值的反应3。然而,也可以接受多次实验,在非缓冲培养基中生长的细胞。 图1A<...
我们利用这些协议处理若干方面的pH稳态。例如,我们已经比较4,5野生型和V-ATP酶缺陷的突变细胞的细胞质和pH响应。我们还研究改变生长条件,尤其是细胞外pH值,葡萄糖3液泡pH响应的影响。重要的是,我们观察到的响应都与其它方法定量的pH测量和一致的生化数据,描述改变质子泵活动。
这里所描述的两个最重要的功能不同的体内 pH测量的荧光基团的...
作者有没有利益冲突的披露。
这项工作是由美国国立卫生研究院R01 GM50322支持到PM凯恩。作者感谢pHluorin所指示的酵母质粒和建议比例pH值测量的约翰斯·霍普金斯大学博士饶Rajini,,凯莱博士A.马丁内斯·穆尼奥斯这些协议,我们的实验室工作。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
MES | Sigma | M8250 |
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