液泡和胞质pH值的测量<em&gt;在体内</em在酵母细胞悬浮液

摘要

可以测量活酵母液泡膜和细胞内pH值（ S。酵母）定位到特定的细胞区室的使用比例荧光染料的细胞。我们描述BCECF-AM，定位于液泡酵母，细胞内pH值与胞浆的比例的pH敏感GFP（酵母pHluorin所指示）测量空泡pH值的程序。

摘要

在酵母细胞中液泡和胞质pH值受到高度监管和整体pH值稳态占据了核心作用。我们描述了协议的比例测量pH值在体内使用pH敏感的荧光团本地化液泡或细胞质。 BCECF，乙酰甲酯形式导入细胞时，它定位在酵母液泡液泡pH值是衡量使用。细胞质pH值的测量是对pH敏感的绿色荧光蛋白表达的酵母启动子的控制下，酵母pHluorin所指示。在荧光计中的酵母细胞悬浮液的荧光比的测量方法进行说明。通过这些协议，单一时间点的pH值测量不同条件下或在不同的酵母突变体进行了比较，并已监测pH值的变化随着时间的推移。这些方法也适合于高通量实验的荧光板读数器的格式。比例比其他AP的pH测量的优点接近目前的用途，潜在实验的问题和解决方案，以备将来使用这些技术的前景也有所说明。

引言

pH值的平衡是一个充满活力和高度调节的过程中，在所有的生物^1,2。生化过程严格监管的pH值，细胞内环境的调整，以使优化常住酶的活性狭窄的pH值范围。然而，细胞内pH稳态可以挑战的快速变化环境的pH值，代谢变化，以及某些信号传导通路。此外，细胞内pH值本身可以作为一个重要的信号。最后，许多细胞器保持腔的pH值是不同于周围的胞质溶胶和必需的细胞器的特定功能。

酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）股数与高等真核生物²的pH的体内平衡机制。酸性细胞内吞/溶酶体途径，pH值主要控制高度保守的空泡质子转运ATP酶（V-ATP酶），随许多EXCHAN蒙古包依赖于pH梯度。所有真核细胞中也有质子出口机制。在真菌和植物，在质膜上的第二，不同的质子泵，PMA1，出口代谢质子和被认为是细胞内pH值和细胞膜电位的主要决定因素。 S.遗传灵活性酵母和其商业上的重要性，提出了一个非常有趣和重要的研究pH值稳态模型^2。

除了细胞器酸化的主要驱动，V-ATP酶被高度管制的酶和我们实验室的兴趣了解V-ATPase的调节机制。为了实现这一目标，我们一直在使用液泡和胞质pH值在体内 pH值的测量：1）监测反应改变外条件，如葡萄糖的剥夺和readdition，2）审查突变，妥协V-ATPase活性的影响， 3）探索COORdination细胞器和质膜质子泵^3-5。这些实验通过强劲的比例适合于使用在酵母细胞中的pH值指标的发展才成为可能。厂房等人首先表明，BCECF（2'7'-二（2 -羧基乙基）-5 - （6） -羧基荧光素），它已被广泛应用，以测量细胞内pH值在哺乳动物细胞中，积聚在酵母液泡而不是在细胞质^6。这种差异在BCECF本地化已被归因于液泡中的水解酶，这是有可能负责裂解乙酰氧甲基酯BCECF-AM（乙酰氧基甲基酯，BCECF）和液泡保留^6。阿里等人进一步开发的液泡pH测量使用BCECF，适应这些测量荧光酶标仪格式。布莱特等人介绍了酵母pHluorin所指示由表达质粒源性ŗ的在酵母细胞内pH值的测定作为一种手段pH敏感的绿色荧光蛋白atiometric ⁸酵母特异性启动子的控制下^9。

BCECF酵母pHluorin所指示的激发光谱是对pH敏感的，因此它们被用作比例的pH值如下：两个激发波长，在一个单一的发射波长测量，荧光的比例提供了一个衡量的pH为^8,10。这些酵母液泡和胞质pH传感器已用于单细胞和人口为基础的测量。 ^6,11测量单细胞进行荧光显微镜和图像分析。液泡膜或胞浆上​​面的两个波长的荧光的测量为每个小区。人口为基础的测量进行适当的荧光功能酶标仪或荧光计中。我们通常是在荧光计测量，因为它提供了方便添加组件，如葡萄糖在con连续动力学测量。下面列出我们目前实验室协议液泡和胞质pH值的测量，二者也容易适应微孔板检测。

研究方案

1。 BCECF-AM 在体内使用液泡pH值测量

1. 长出一个50毫升的液体培养过夜所需的媒体要被测量的酵母菌株。我们的目标是有细胞数中期（OD值（在600nm处的光密度）为约0.8的悬浮液中的测量）。
2. 颗粒通过离心分离酵母细胞。悬浮颗粒0.6毫升培养基中生长和转移到已称重的离心管。颗粒细胞再次离心2,000 XG，持续60秒。尽可能完全去除上清，然后权衡细胞沉淀。重悬沉淀至最终密度为0.5克/毫升（重量/体积），将被添加到本卷文化将得到约200毫克的细胞沉淀，加入200μl缓冲液使最终体积为400μl。
3. 添加BCECF-AM的细胞悬浮液从12毫米的股票，在DMSO中制备终浓度为50mM的。拌匀，然后公司ubate细胞在30℃下30分钟。在摇摆平台或辊筒。
4. 虽然细胞培育，准备校准缓冲区。校准的缓冲液含有50mM的MES（2 - （N-吗啉代）乙磺酸），50mM的HEPES（4 - （2 - 羟基乙基）-1 - 哌嗪乙磺酸），50mM的氯化钾，氯化钠的50mM乙酸铵，0.2M，的10mM叠氮化钠，10mM的2 - 脱氧葡萄糖，并已被调整，以将pH值适当的校准范围内，用NaOH或HCl。 （注意：叠氮化钠是剧毒，应小心处理。）在野生型细胞中的pH值的测量，我们会准备几个校准混合物在pH值5.5至6.5，但预计将有更碱性空泡，pH值的突变体（ VMA突变），我们会准备更多，更高的pH缓冲液。
5. 各pH校准缓冲分装2毫升到15毫升锥形管，并添加莫能菌素（15毫米的股票）和尼日利亚菌素（2毫股票）给最终浓度莫能110微米和15微米尼日利亚菌素，Respectively。拌匀的旋涡混合器。 （注意：莫能菌素，尼日利亚菌素是有毒的，应谨慎处理。）
6. 当BCECF-AM孵育时间完成后，沉淀细胞悬浮液通过离心分离，持续30秒，在2000×g离心微量离心。重悬细胞为1毫升生长培养基中缺乏葡萄糖和离心机如上。重复该洗涤步骤一次，然后将沉淀重悬于200微升生长培养基中不含葡萄糖。置于冰上。
7. 的细胞悬浮液中加入20μl上述制备的各pH校正管。在30°C孵育30-60分钟。辊式转鼓上。
8. 设置的荧光计，交替测量在激发波长450纳米和490纳米的发光波长为535 nm。样品室的温度设定至30℃。在连续搅拌下将混合物在比色皿中执行的所有测量。
9. 加入1.96毫升1 mM的MES（调整至pH为5或7的pH值取决于细胞的生长培养基中的一个ND实验设计）。到试管中，加入20μl的细胞悬液。启动荧光测量。我们同时收集连续的动能和时间点在不同的实验数据。对于连续的动力学数据，每6秒测量5分钟，然后添加葡萄糖至最终的50mM的葡萄糖浓度，并继续测量5-10分钟。对于单一时间点的测量，我们一般采取的测量在1和5分钟。加入比色皿的细胞后，添加葡萄糖在动力学测量，然后进行下一次测量5分钟。后加入葡萄糖。这些增加的可以是多种多样的，并且，也可以添加额外的组件（抑制剂等）。
10. 实验测量完成后，取出校准管从30°C孵育，整个2毫升的量为每次转移的荧光计比色皿。荧光测量在相同的设置（见1.8），每隔5秒，共30秒以上，每个样品。
11. 荧光数据导出到Microsoft Excel。 （对于我们的荧光计，这要求出口数据作为制表符分隔的形式导入到Excel中的文本。）获得校准曲线计算荧光的比例在490纳米至450纳米每个校准混合物。的荧光的比率，然后与pH值的关系作图得到的校准曲线。
12. 实验数据转换荧光比使用标准曲线计算pH值。液泡膜的pH值，然后随时间（动力学的pH值的变化），或者在各种条件下（ 图1），或在不同的突变株相比。

2。 在体内使用酵母pHluorin所指示胞内pH值的测量

1. 变换pHluorin所指示质粒标准协议与酵母所需的酵母菌株，并选择补充基本培养基缺乏尿嘧啶（SC-尿嘧啶）的转化。
2. SC-尿嘧啶转化细胞长出了50毫升液体培养数中期（OD _{的600 = 0.8或更低）。}
3. 准备校准标准所描述的液泡中的pH值，但缓冲区适当的pH值范围为胞质pH测量，一般pH值6-8。等分试样2毫升校准缓冲液调节到所需的pH值到15毫升锥形管的一些。添加莫能菌素，尼日利亚菌素（1.4）如上所述，拌匀。
4. 如上所述通过离心收集细胞，将沉淀重悬于600微升生长培养基中。转移至称量微量离心管中，沉淀细胞，在5,000 rpm离心30秒。将沉淀重悬于1毫升生长培养基中没有葡萄糖（SC-尿嘧啶，葡萄糖），再次沉淀细胞，并重复。最后离心后，除去上清液尽可能彻底和权衡细胞沉淀。重悬细胞至最终密度为0.5克/毫升的SC-尿嘧啶没有葡萄糖。
5. 加入20μl的细胞悬液，每管校准缓冲的旋涡混合器拌匀。孵育30℃60分钟，一个旋转的鼓形转子。
6. 设置为在波长405和485nm的激发和发射波长为508 nm的荧光计。继续进行，单一的时间点或动力学测量和BCECF测量上述用于添加葡萄糖。
7. 测量荧光校准样品，并构建BCECF（1.10-1.11）的校准曲线。 A地块的荧光比与pH值线性范围最胞质pH值测量值（PH值^{6.0-8.0）9，}实验很容易转换荧光比率测量pH值。

结果

图1给出营养丰富的培养基中生长的野生型酵母细胞（酵母提取物，蛋白胨-葡聚糖YEPD）与50毫米的MES缓冲pH值至5液泡pH值获得的数据。我们经常在缓冲介质中生长的细胞，因为培养基的pH变化相当显着的期间，特别是对基本培养基中生长过夜，我们已经发现，生长培养基的pH值可能会影响液泡pH值的反应^3。然而，也可以接受多次实验，在非缓冲培养基中生长的细胞。 图1A<...

讨论

我们利用这些协议处理若干方面的pH稳态。例如，我们已经比较^4,5野生型和V-ATP酶缺陷的突变细胞的细胞质和pH响应。我们还研究改变生长条件，尤其是细胞外pH值，葡萄糖³液泡pH响应的影响。重要的是，我们观察到的响应都与其它方法定量的pH测量和一致的生化数据，描述改变质子泵活动。

这里所描述的两个最重要的功能不同的体内 pH测量的荧光基团的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250