Mesure du pH vacuolaire et cytosolique<em&gt; In Vivo</em&gt; En cellule de levure Suspensions

Résumé

PH vacuolaire et cytosolique peut être mesurée en levures vivantes ( S. cerevisiae) Cellules en utilisant des colorants fluorescents ratiométriques localisés dans des compartiments cellulaires spécifiques. Nous décrivons les procédures pour mesurer le pH vacuolaire avec BCECF-AM, qui se localise dans la vacuole de la levure, et le pH cytosolique avec une GFP sensible au pH quotientométrique cytosolique (levure pHluorin).

Résumé

Vacuolar et pH cytosolique sont très réglementés dans les cellules de levure et d'occuper un rôle central dans l'homéostasie globale du pH. Nous décrivons les protocoles de mesure radiométrique de pH in vivo en utilisant des fluorophores sensibles au pH localisés dans la vacuole ou cytosol. PH vacuolaire est mesurée en utilisant BCECF, qui se localise dans la vacuole dans la levure lors de son introduction dans les cellules, sous sa forme d'ester d'acétoxyméthyle. PH cytosolique est mesuré avec une GFP sensible au pH exprimé sous le contrôle d'un promoteur de levure, la levure pHluorin. Les méthodes de mesure des ratios de fluorescence dans des suspensions de cellules de levure dans un fluorimètre sont décrits. Grâce à ces protocoles, des mesures ponctuelles de temps simples de pH dans des conditions différentes ou dans différents mutants de levure ont été comparées et les variations de pH au cours du temps ont été surveillés. Ces méthodes ont également été adaptés au format du lecteur de plaque à fluorescence pour des expériences à haut débit. Avantages de mesures de pH ratiométriques par rapport aux autres apapproches en cours d'utilisation, les problèmes potentiels et les solutions expérimentales, et les perspectives pour le futur usage de ces techniques sont également décrites.

Introduction

homéostasie du pH est un processus dynamique et très réglementé dans tous les organismes ^1,2. Processus biochimiques sont strictement réglementées par le pH et les environnements intracellulaires sont accordés sur des gammes de pH étroite pour permettre une activité optimale des enzymes résidentes. Cependant, l'homéostasie du pH intracellulaire peut être contestée par des changements rapides dans l'environnement pH, les changements métaboliques et certaines voies de signalisation. En outre, le pH intracellulaire peut se servir comme un signal important. Enfin, de nombreux organites maintenir des valeurs de pH luminales qui sont distincts du cytosol environnante et indispensable au bon fonctionnement des organites spécifiques.

Saccharomyces cerevisiae actions d'un certain nombre de mécanismes d'homéostasie du pH avec eucaryotes supérieurs ^2. Dans les organites acides de la voie d'endocytose / lysosomale, le pH est principalement contrôlée par l'ATPase vacuolaire translocation de protons hautement conservée (V-ATPase), agissant de concert avec de nombreux échangers dépendant du gradient de pH. Toutes les cellules eucaryotes ont aussi des mécanismes d'exportation de protons. Chez les champignons et les plantes, une seconde, la pompe à protons distinct à la membrane plasmique, PMA1, les exportations protons métaboliques et l'on croit être le déterminant majeur de pH cytosolique et du potentiel de membrane plasmique. La flexibilité génétique de S. cerevisiae et son importance commerciale, en ont fait un modèle très intéressant et important pour l'étude de l'homéostasie du pH ^2.

En plus d'être les principaux moteurs de organite acidification, V-ATPase sont très réglementés et enzymes de notre laboratoire s'intéresse aux mécanismes de régulation V-ATPase comprendre. Pour atteindre cet objectif, nous avons eu recours à des mesures de pH in vivo de pH vacuolaire et cytosolique: 1) suivre les réponses à l'évolution des conditions extracellulaires, comme la privation de glucose et readdition, 2) d'examiner les effets des mutations qui compromettent l'activité V-ATPase, et 3) d'explorer la coornation des organelles et la membrane plasmique pompes à protons ^3-5. Ces expériences ne sont devenus possibles grâce à l'élaboration d'indicateurs de pH ratiométriques robustes qui se prêtent à utiliser dans les cellules de levure. . Plant et al ont d'abord montré que BCECF (2'7'-bis-(2-carboxyéthyl) -5 - (et 6)-carboxyfluorescéine), qui a été largement utilisé pour mesurer le pH cytosolique dans les cellules de mammifères, s'accumule dans la vacuole de la levure au lieu de le cytosol ^6. Cette différence de BCECF localisation a été attribué aux nombreuses enzymes hydrolytiques dans la vacuole, qui sont susceptibles responsable du clivage de l'ester méthylique de BCECF acétoxy-AM (ester acétoxyméthylique de BCECF) et vacuolaire rétention ^6. Ali et al. ⁷ développées mesure du pH vacuolaire utilisant BCECF et adapté ces mesures à un format de lecteur de plaques à fluorescence. Brett et al. Introduit pHluorin de levure en tant que moyen de mesure du pH cytosolique dans la levure par l'expression d'un r plasmidiqueatiometric GFP sensible au pH ⁸ sous le contrôle d'un promoteur spécifique de levure ^9.

Les spectres d'excitation des deux BCECF et la levure pHluorin sont sensibles au pH, si elles sont utilisées comme indicateurs de pH ratiométriques dans lequel le rapport de fluorescence à deux longueurs d'onde d'excitation, mesurée à une longueur d'onde d'émission, fournit une mesure de pH ^8,10. Ces levures capteurs de pH vacuolaire et cytosolique ont été utilisées pour les deux mesures unicellulaires et basée sur la population. Mesures monocellulaires ^6,11 sont réalisées par microscopie à fluorescence et une analyse d'image. Fluorescence vacuolaire ou cytosolique à deux longueurs d'onde est mesurée pour chaque cellule. Les mesures basées sur la population sont réalisées soit dans un lecteur de microplaques avec des capacités de fluorescence appropriés ou dans un fluorimètre. Nous avons généralement fait nos mesures dans un fluorimètre, car il permet un accès facile pour l'ajout d'éléments tels que le glucose au cours de conmesures cinétiques continue. Nos protocoles de laboratoire courants pour la mesure du pH vacuolaire et cytosolique sont énumérés ci-dessous, les deux sont également facilement adapté aux essais en microplaques.

Protocole

1. Mesure du pH Vacuolar in vivo en utilisant BCECF-AM

1. Cultiver une culture liquide de 50 ml de la souche de levure à mesurer dans le milieu souhaité pendant une nuit. L'objectif est d'avoir des cellules en phase mi-log (DO600 (densité optique à 600 nm) d'environ 0,8 pour la suspension).
2. Pellet les cellules de levure par centrifugation. Reprendre le culot dans 0,6 ml de milieu de croissance et la transférer dans un tube de centrifugation qui a été pesé antérieurement. Pellet les cellules à nouveau dans un centrifuger à 2000 g pendant 60 sec. Eliminer le surnageant aussi complètement que possible, puis peser le culot cellulaire. Reprendre le culot à une densité finale de 0,5 g / ml (p / v), une culture de ce volume va donner un culot cellulaire d'environ 200 mg, et 200 pi de tampon seraient ajoutés pour donner un volume final de 400 pl.
3. Ajouter BCECF-AM à la suspension de cellules à une concentration finale de 50 mM à partir d'un stock 12 mM préparée dans du DMSO. Bien mélanger puis incUbate les cellules à 30 ° C pendant 30 min. sur une plate-forme à bascule ou le tambour du rouleau.
4. Alors que les cellules sont en incubation, préparer des tampons d'étalonnage. Le tampon d'étalonnage contient 50 mM de MES (2 - (N-morpholino) éthanesulfonique), 50 mM de HEPES (4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique acide), 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 0,2 M d'acétate d'ammonium, 10 mM d'azoture de sodium, et 10 mM de 2-désoxyglucose, et est ajusté au pH valeurs appropriées pour votre gamme d'étalonnage avec NaOH ou HCl. (Attention: L'azoture de sodium est très toxique et doit être manipulé avec soin.) Pour la mesure du pH dans les cellules de type sauvage, nous serions préparer plusieurs mélanges d'étalonnage à pH 5,5 à 6,5, mais pour les mutants devraient avoir un pH vacuolaire plus alcaline ( mutants EGV), nous préparer supplémentaires, des tampons de pH plus élevés.
5. Aliquote de 2 ml de tampon d'étalonnage pour chaque pH dans tubes coniques de 15 ml et ajouter monensin (Stock 15 mm) et nigéricine (Stock 2 mM) pour donner des concentrations finales de 110 pm monensin et 15 pm nigéricine, respectively. Mélangez bien sur un vortex. (Attention: les deux monensin et nigéricine sont toxiques et doivent être manipulés avec précaution.)
6. Lorsque la durée d'incubation BCECF-AM est terminée, pellet la suspension cellulaire par centrifugation pendant 30 sec à 2000 xg dans une microcentrifugeuse. Resuspendre les cellules est de 1 ml de milieu de croissance dépourvu de glucose et centrifugeuse comme ci-dessus. Répétez cette étape de lavage une fois, puis remettre le culot dans 200 ul de milieu de croissance sans glucose. La place sur la glace.
7. Ajouter 20 ul de la suspension cellulaire dans chaque tube d'étalonnage du pH préparé ci-dessus. Incuber à 30 ° C pendant 30-60 min. sur un tambour de rouleau.
8. Réglez le fluorimètre pour mesurer en alternance à des longueurs d'onde d'excitation 450 nm et 490 nm, à la fois avec une longueur d'onde d'émission de 535 nm. Réglez la température de la chambre de l'échantillon à 30 ° C. Effectuer toutes les mesures avec une agitation continue du mélange dans la cuvette.
9. Ajouter 1,96 ml de 1 mM de MES (ajusté à pH 5 ou 7, selon le pH du milieu de culture des cellules d'une le design expérimental). Ajouter 20 pl de suspension cellulaire dans la cuvette. Initier des mesures de fluorescence. Nous recueillons aussi des données temporelles ponctuelles dans différentes expériences de cinétique et continue. Pour les données cinétiques continues, nous prenons des mesures toutes les 6 sec pendant 5 min, puis ajouter le glucose à une concentration de glucose finale de 50 mM, et continuer mesure pendant 5-10 min. Pour des mesures de temps seul point, nous prenons des mesures généralement à 1 et 5 min. après addition de cellules dans la cuvette, ajouter le glucose comme dans les mesures cinétiques, puis une autre mesure 5 min. après l'addition de glucose. Ces ajouts peuvent être variés, et des composants supplémentaires (inhibiteurs, etc) peuvent également être ajoutés.
10. Après les mesures expérimentales sont terminées, retirez les tubes d'étalonnage à partir de la 30 ° C incubation et de transférer la totalité du volume de 2 ml pour chaque dans la cuvette de fluorimètre. Mesurer la fluorescence avec les mêmes paramètres (voir 1.8) toutes les 5 sec sur un total de 30 secondes pour chaque échantillon.
11. Exporter des données de fluorescence à Microsoft Excel. (Pour notre fluorimètre, ce qui nécessite l'exportation des données sous forme de texte sous forme délimité par des tabulations et l'importation dans Excel.) D'obtenir une courbe d'étalonnage en calculant le ratio de fluorescence à 490 nm à 450 nm pour chaque mélange d'étalonnage. Le rapport de fluorescence est ensuite tracée en fonction du pH pour obtenir une courbe d'étalonnage.
12. Convertir les données expérimentales de rapport de fluorescence et de calculer le pH à l'aide de la courbe standard. PH vacuolaire peut alors en fonction du temps (cinétique de changements de pH) ou par rapport sous diverses conditions (Figure 1) ou dans différentes souches mutantes.

2. Mesure du pH cytosolique in vivo en utilisant pHluorin de levure

1. Transformer la souche de levure souhaitée avec la pHluorin de plasmide de levure par des protocoles standard, et sélectionner les transformants sur un minimum sans uracile de milieu supplémenté (SC-uracile).
2. Cultiver une culture liquide de 50 ml de cellules transformées dans SC-uracile à la phase mi-log (OD _{600 = 0,8 ou plus bas).}
3. Préparer des normes d'étalonnage comme décrit pour le pH vacuolaire, mais tampon à une plage de pH appropriée pour la mesure du pH cytosolique, généralement pH 8.6. Aliquote de 2 ml de solution d'étalonnage ajusté au pH désiré dans plusieurs tubes coniques de 15 ml. Ajouter monensin et nigéricine comme décrit ci-dessus (1.4) et bien mélanger.
4. Récolter les cellules par centrifugation comme décrit ci-dessus, et remettre le culot dans 600 ul du milieu de croissance. Transfert à un tube de pesée, et sédimenter les cellules par centrifugation à 5000 rpm pendant 30 sec. Reprendre le culot dans 1 ml de milieu de croissance sans glucose (SC-uracile,-glucose), sédimenter les cellules et répétez. Après la dernière centrifugation, éliminer le surnageant aussi complètement que possible et peser le culot cellulaire. Resuspendre les cellules à une densité finale de 0,5 g / ml dans du SC-uracile sans glucose.
5. Ajouter 20 pl de suspension cellulaire dans chaque tube de tampon d'étalonnage et bien mélanger sur un agitateur vortex. Incuber à 30 ° C sur un rotor de tambour de filage pendant 60 min.
6. Mettre en place le fluorimètre pour l'excitation aux longueurs d'onde 405 et 485 nm et une longueur d'onde d'émission de 508 nm. Procéder à un seul point du temps ou des mesures cinétiques et l'ajout de glucose comme décrit ci-dessus pour la mesure BCECF.
7. Mesurer la fluorescence d'échantillons d'étalonnage et tracer une courbe d'étalonnage pour BCECF (voir 1.10-1.11). Une parcelle de rapport de fluorescence en fonction du pH est linéaire sur la plage de la plupart des mesures de pH cytosolique (pH 6,0-8,0) ^9, la mesure du rapport de fluorescence de manière expérimentale sont facilement convertis au pH.

Résultats

La figure 1 présente les données de pH vacuolaire obtenus sur des cellules de levure de type sauvage cultivées dans un milieu riche (extrait de levure-peptone-dextran; YEPD) tamponnée à pH 5 avec 50 mM MES. Nous cultivons souvent les cellules dans un milieu tamponné parce que le pH du milieu peut changer de façon spectaculaire au cours de la croissance pendant la nuit, surtout pour un milieu minimal, et nous avons constaté que le pH du milieu de croissance peut influencer les réponses de pH vac...

Discussion

Nous avons utilisé ces protocoles pour répondre à un certain nombre d'aspects de l'homéostasie du pH. Par exemple, nous avons comparé les réponses cytosolique et le pH des cellules mutantes et de type sauvage V-ATPase déficient ^4,5. Nous avons également examiné les effets des conditions de croissance modifiées, le pH extracellulaire, en particulier sur la réponse du pH vacuolaire de glucose ^3. Surtout, les réponses que nous observons sont cohérents avec d'autres méthodes d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250