Vakuolar ve sitosolik pH Ölçümü<em&gt; In Vivo</em&gt; Maya hücre süspansiyonlarında

Özet

Vakuolar ve sitozolik pH canlı maya ölçülebilir ( S. cerevisiae) Özel hücre bölmeleri lokalize rasyometrik floresan boyalar kullanarak hücreleri. Biz maya vakuol için lokalize BCECF-AM, ve bir sitozolik rasyometrik pH duyarlı GFP (maya pHluorin) ile sitozolik pH ile vakuolar pH ölçümü için prosedürler tarif.

Özet

Vakuolar ve pH sitozolik yüksek maya hücreleri düzenlenmiştir ve genel pH dengesini merkezi bir rol işgal edilir. Biz vakuol veya sitoplazmada lokalize pH duyarlı fluorophores kullanarak in vivo pH oranlı metrik ölçümü için protokolleri tarif. Vakuolar pH onun asetoksimetil ester halinde hücreler içine dahil edildikleri zaman, maya vakuol lokalize BCECF ile ölçülmektedir. Sitosolik pH değeri, bir maya promotör, maya pHluorin kontrolü altında ifade edilen, pH'ye duyarlı, GFP ile ölçülür. Bir fluorimetre maya hücre süspansiyonlarında floresan oranları ölçümü için yöntemler tarif edilmiştir. Bu protokollerin sayesinde, farklı koşullar altında ya da farklı maya mutant pH tek bir zaman noktasında ölçümleri karşılaştırılmıştır ve zaman içinde pH değişiklikleri takip edilmiştir. Bu yöntemler aynı zamanda yüksek hacimli deneyler için flöresanlı bir plaka okuyucu biçimine uyarlanmıştır. Diğer ap üzerinde rasyometrik pH ölçümleri Avantajlarışu anda kullanılan, olası deneysel sorunlar ve çözümleri ve bu tekniklerin ileride kullanmak için umutları izlenen yolun da açıklanmıştır.

Giriş

pH dengesini bütün organizmalar ^1,2 dinamik ve oldukça düzenli bir süreçtir. Biyokimyasal süreçlerin sıkı pH tarafından düzenlenir ve hücre içi ortamlarda ikamet enzimlerin en iyi etkinlik sağlamak için dar pH aralıkları için ayarlanmıştır. Ancak, hücre içi pH dengesini çevre pH, metabolik değişimler ve bazı sinyal yolları hızlı değişiklikler itiraz edilebilir. Buna ek olarak, hücre içi pH önemli bir sinyal olarak kendini hizmet edebilir. Son olarak, birçok organeller organel-özel işlevler için çevredeki sitoplazmada farklı ve gerekli olan lumenal pH değerlerini korumak.

Yüksek ökaryotlar ² ile pH dengesini mekanizmaların maya Saccharomyces cerevisiae hisse bir dizi. Lizozomal / endositik yolunun asidik organeller olarak, pH öncelikle birçok exchan ile birlikte hareket eden, son derece korunmuş vakuolar proton-translocating ATPaz (V-ATPaz) tarafından kontrol edilirpH degrade bağlıdır Gers. Tüm ökaryotik hücreler aynı zamanda proton verme mekanizması vardır. Olarak mantar ve bitkiler, plazma zarı ikinci bir, ayrı proton pompa, Pma1, ihracat metabolik proton ve sitozolik pH ve plazma membran potansiyeli en önemli belirleyici olduğuna inanılıyor. S. genetik esnekliği cerevisiae ve ticari önemi, bu pH dengesini ² eğitim için çok ilginç ve önemli bir model yaptık.

Organel asitlenme birincil sürücüleri olmasının yanı sıra, V-ATPaz yüksek enzimler düzenlenir ve laboratuvar V-ATPaz düzenleme mekanizmaları anlamak ilgileniyor. Bu hedefe doğru, biz vakuolar ve sitozolik pH in vivo pH ölçümlerinde kullanıyorum: 1) mutasyonların etkilerini bu uzlaşma V-ATPaz aktivitesini incelemek için glikoz yoksunluk ve readdition, 2 olarak değişen hücre dışı koşullar,) yanıtları izlemek için, ve 3) koordine keşfetmek içinorganel ve plazma membran proton pompa ^3-5 koordi-nasyonunu sağlıyor. Bu deneyler sadece maya hücreleri kullanmak için uygun sağlam rasyometrik pH göstergelerin geliştirilmesi yoluyla mümkün oldu. . Memeli hücrelerinde sitosolik pH'ını ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır,, maya vakuol birikir - Bitki ve ark olanlar BCECF ((ve 6)-karboksifloresan 2'7'-Bis-(2-karboksietil) -5) gösterdi yerine sitoplazmada ^6. BCECF lokalizasyon bu fark BCECF-AM (BCECF arasında asetoksimetil ester) ve vaküler tutma ⁶ asetoksi metil esterin parçalanması için olası sorumludur vakuol birçok hidrolitik enzimler, atfedilmiştir. Ali ve diğ. ⁷ daha BCECF kullanılarak vakuolar pH ölçümü geliştirilen ve bir floresan plaka okuyucu biçimi için bu ölçümler uyarlanmıştır. Brett ve ark. Bir plazmid kaynaklı R ifade ederek maya sitosolik pH ölçümü için bir araç olarak maya pHluorin tanıtılanBir mantar-spesifik promotör ⁹ arasında kontrol altında atiometric pH duyarlı GFP ^8.

BCECF ve maya pHluorin iki uyarma spektrumları pH'a duyarlıdır, bu nedenle tek bir emisyon dalga boyunda ölçülen iki uyarma dalga boyu, önceki floresans oranı pH ^8,10 arasında bir ölçü sağlar ki rasyometrik pH göstergesi olarak kullanılır. Bu maya vakuolar ve sitozolik pH sensörleri hem tek hücreli ve toplum temelli ölçümler için kullanılmaktadır. Tek hücreli ölçümleri ^6,11 floresan mikroskopi ve görüntü analizi ile gerçekleştirilir. Iki dalga boyunda Vakuolar veya hücre floresan her bir hücre için ölçülür. Popülasyon tabanlı ölçümleri uygun floresan özelliklerine sahip bir mikroplaka okuyucu ya da ya da bir fluorimetre gerçekleştirilir. Bu con sırasında glikoz gibi bileşenlerin yanı sıra kolay erişim sağlar çünkü genellikle, bir florimetresi bizim ölçümleri yapmışmanın hikayesi kinetik ölçümleri. Vakuolar ve sitosolik pH değerinin ölçümü için mevcut laboratuar protokoller aşağıda belirtilmiştir; hem de kolayca mikroplaka deneyleri için uyarlanmıştır.

Protokol

1. BCECF-AM kullanarak in vivo Vakuolar pH Ölçümü

1. Gece boyunca istenen ortam ölçülecek olan maya suşu, 50 ml sıvı kültür büyütün. Amaç, (OD600 (600 nm'de optik yoğunluk) süspansiyon yaklaşık 0.8 ölçümü) orta log fazında hücrelerin sahip olmaktır.
2. Pelet santrifüj maya hücreleri. Büyüme ortamı ve önceden tartılan edilmiş bir mikrosantrifüj tüpüne transfer 0.6 ml pelletini. 60 saniye boyunca 2000 x g'de bir mikrosantrifüj içinde yeniden Pelet hücreleri. Olarak tamamen mümkün süpernatant kaldırmak ve daha sonra hücre pelet tartmak. 0.5 g / ml (k / h) bir son yoğunluk elde etmek için pelletini, bu birimin bir kültür, yaklaşık olarak 200 mg arasında hücre topağı, ve tamponun 200 ul verecek 400 ul'lik nihai bir hacim verecek şekilde eklenebilir.
3. DMSO içinde hazırlanan 12 mM stoktan 50 mM'lik bir son konsantrasyonda hücre süspansiyonu BCECF-AM ekleyin. Iyi ve daha sonra inc Mix30 dakika boyunca 30 ° C'de hücre Ubate. bir sallanan bir platform veya rulo davul.
4. Hücreler inkübe edilirken, kalibrasyon tamponlar hazırlamak. , 50 mM HEPES (4 - (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit), 50 mM KCI, 50 mM NaCI, 0.2 M amonyum asetat, - kalibrasyon tamponu 50 mM MES ((N-morfolino) etansülfonik asit, 2) içerir 10 mM sodyum azit ve 10 mM 2-deoksiglukoz, ve pH değeri ayarlanır NaOH veya HCI ile kalibrasyon aralığı için uygun değer verir. (Dikkat: Sodyum azid yüksek derecede toksiktir ve dikkatle ele alınmalıdır.) Yabani tip hücrelerde pH ölçümü için, (6.5, ama bir daha alkali vakuolar pH olması bekleniyor mutantlar için pH 5.5 'de birkaç kalibrasyon karışımları hazırlayacak vma mutantlar), ek, daha yüksek pH tamponları hazırlayacak.
5. Kısım 2 15 ml konik tüpler her bir pH için kalibrasyon tampon ml, ve son 110 mcM monensin konsantrasyonu ve 15 mcM nigericin, r vermek için monensin (15 mM stok) ve nigericin (2 mM stok) ekleyinespectively. Bir vorteks karıştırıcıda iyice karıştırın. (Dikkat: monensin ve nigericin Hem toksik ve dikkatle ele alınmalıdır.)
6. bir mikrosantrifüj içinde 2,000 x g'de 30 saniye boyunca santrifüj ile BCECF-AM inkübasyon süresi tamamlandıktan sonra, pelet hücre süspansiyonu. Hücrelerin tekrar yukarıdaki gibi santrifüj eksik glukoz ve büyüme ortamı 1 ml'dir. Bir kez bu yıkama adımı yineleyin ve sonra glikoz olmadan büyüme orta 200 ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Buz üzerinde yer.
7. Yukarıda hazırlanan her bir pH kalibrasyon tüp hücre süspansiyonu, 20 ul ekle. 30-60 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin. bir rulo davul.
8. Dönüşümlü olarak uyarım dalga boyu 450 nm ve 490 nm, 535 nm ve emisyon dalga boyu ile hem de ölçmek için florimetresi ayarlayın. 30 ° C için örnek odası sıcaklığı ayarlayın Küvet içinde, karışımın sürekli karıştırma ile tüm ölçümler gerçekleştirme.
9. 1 mM MES ve 1.96 ml (hücrelerin büyüme ortamı arasında bir pH değerine bağlı olarak pH değeri 5 ya da 7'ye ayarlandı eklemend deneysel tasarım). Küvet içine hücre süspansiyonu, 20 ul ekle. Floresan ölçümleri başlatın. Biz sürekli kinetik ve farklı deneylerde zaman noktası veri hem toplamak. Sürekli kinetik veriler için, 5 dakika için 6 saniye ölçüm almak, sonra 50 mM'lik bir son glükoz konsantrasyonu için glikoz ekleyin ve 5-10 dakika için ölçü devam etmektedir. Tek zaman noktası ölçümleri için, biz genel olarak 1 ölçümleri almak ve 5 dk. küvete hücrelerin eklenmesinden sonra, kinetik ölçümler olarak glikoz eklenmektedir ve daha sonra başka bir ölçüm 5 dakika sürer. glukoz ilave edildikten sonra. Bu eklemeler değişik olabilir ve ek bileşenler (inhibitörleri, vs) de ilave edilebilir.
10. Deneysel ölçümler tamamlandıktan sonra, 30 ° C'de kuluçka, kalibrasyon tüpleri kaldırmak ve florimetresi küvete her biri için tüm 2 ml hacme aktarın. Her 5 sn her bir örnek için 30 sn olmak üzere toplam üzerinden (1.8 bakınız) aynı ayarlarda floresan ölçün.
11. Microsoft Excel'e floresan İhracat verileri. (Bizim florimetresi için, bu Excel'e sekme ile sınırlandırılmış formu ve ithalat metin olarak veri ihracat gerektirir.) Her kalibrasyon karışım için 450 nm 490 nm floresan oranı hesaplayarak bir kalibrasyon eğrisi elde. Floresans oranı, daha sonra, bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için pH değeri genel çizilir.
12. Floresan oranı deneysel verileri dönüştürmek ve standart eğrisi kullanılarak pH hesaplar. Vakuolar sonra pH süresi (pH değişimi kinetiği) karşı çizilen veya çeşitli koşulları (Şekil 1) altına ya da farklı mutant suşları karşılaştırıldığında olabilir.

2. Maya pHluorin kullanarak in vivo Sitosolik pH Ölçümü

1. Standart protokoller plazmid maya pHluorin ile istenilen maya suşu dönüştürmek ve takviye az orta eksik urasil (SC-urasil) üzerinde transformantlar için seçin.
2. Orta log fazı (OD SC-urasil dönüştürülmüş hücre, 50 ml sıvı kültür büyütün _{600 = 0.8 veya daha düşük).}
3. Vakuolar pH, ancak sitosolik pH ölçümleri, genellikle pH 6-8 için uygun bir pH tampon için tarif edilen kalibrasyon standardı hazırlayın. Kalibrasyon tampon kısım 2 mi birkaç 15 ml konik tüp içine istenen pH değerine ayarlandı. (1.4) yukarıda tarif edildiği gibi Monensin ve nigericin ekleyin ve iyice karıştırın.
4. Yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj ile hücreler hasat ve büyüme ortamı 600 ul pelletini. 30 saniye için 5000 rpm'de santrifüjleme ile tartılmış bir mikrosantrifüj tüpü ve topak hücrelere transfer. Yine glikoz (SC-urasil-glikoz), topak hücrelere olmadan büyüme ortamı içinde 1 ml pelletini ve tekrarlayın. Santrifüj işleminden sonra son olarak tamamen mümkün süpernatantı ve hücre pelletini tartın. Resim glukoz ile SC-urasil, 0.5 g / ml 'lik bir nihai yoğunluğa süspansiyon hücreleri.
5. Kalibrasyon tampon her tüpe hücre süspansiyonu, 20 ul ekleyin ve bir vorteks karıştırıcıda iyice karıştırın. 3 inkübe0 ° 60 dakika için dönen bir davul rotor üzerinde C.
6. Dalga boyları 405 ve 485 nm eksitasyon ve 508 nm emisyon dalga boyu için florimetresi ayarlayın. BCECF ölçümü için yukarıda tarif edildiği gibi tek bir zaman noktasında veya kinetik ölçümleri ve glikoz ilave devam edin.
7. Kalibrasyon numuneleri arasında floresan ölçmek ve BCECF (1.10-1.11 bakınız) gibi bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak. Floresans oranı genel pH Bir arsa en sitosolik pH ölçümleri (pH 6.0-8.0) ⁹ aralığında doğrusaldır, bu nedenle deneysel floresans oranı ölçümleri pH'ını kolayca dönüştürülür.

Sonuçlar

50 mM MES pH 5'e tamponlu: Şekil 1 zengin bir ortamda yetiştirilen yabani tip maya hücreleri (YEPD maya ekstresi, pepton-dekstran) üzerinde elde vakuolar pH veriler sunulmuştur. Ortamın pH özellikle minimal ortam için gece büyüme sırasında oldukça önemli ölçüde değişebilir, çünkü genellikle tamponlu ortam içinde hücrelerin büyümesi, ve büyüme ortamının pH'ı, pH vakuolar yanıtları ³ etkileyebilir bulduk. Çok sayıda deney tamponsuz ortamda hücrelerin ...

Tartışmalar

Biz pH dengesinin yönlerini bir dizi adrese bu protokolleri kullanmış olurlar. Örneğin, ^4,5-yabani tip ve V-ATPaz eksikliği mutant hücreler sitozolik pH ve yanıtlar bakımından karşılaştırdık. Ayrıca glikoz ³ vakuolar pH yanıt değişmiş büyüme koşulları, özellikle hücre dışı pH, etkilerini inceledik. Önemlisi, biz gözlemlemek tepkiler hem nicel pH ölçümü diğer yöntemlerle ve proton pompa değişmiş faaliyetleri anlatan biyokimyasal verilerle uyumludur.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250