السريع إنتاجية عالية أميلوز تحديد في تجميد المجفف عينات درنة البطاطس

Summary

يصف هذا البروتوكول عالية من خلال وضع أسلوب اللونية التي تعتمد على تشكيل المعقدة بين اليود وسلاسل من جزيئات الجلوكوز في النشا. اليود تشكل المجمعات مع كل أميلوز وسلاسل طويلة داخل أميلوبكتين. بعد إضافة اليود إلى عينة النشا، واستيعاب الحد الأقصى من أميلوز والأميلوبكتين يحدث في 620 و 550 نانومتر، على التوالي. يمكن تقدير نسبة أميلوز / أميلوبكتين من نسبة القيم الامتصاصية نانومتر 620 و 550 ومقارنتها إلى منحنى القياسية التي يتم رسم تركيزات محددة معروفة ضد القيم الاستيعاب. هذا إنتاجية عالية، وطريقة غير مكلفة هو موثوق بها وقابلة للتكرار، والسماح للتقييم أعداد كبيرة من الحيوانات المستنسخة البطاطس.

Abstract

يصف هذا البروتوكول عالية من خلال وضع أسلوب اللونية التي تعتمد على تشكيل المعقدة بين اليود وسلاسل من جزيئات الجلوكوز في النشا. اليود تشكل المجمعات مع كل أميلوز وسلاسل طويلة داخل أميلوبكتين. بعد إضافة اليود إلى عينة النشا، واستيعاب الحد الأقصى من أميلوز والأميلوبكتين يحدث في 620 و 550 نانومتر، على التوالي. يمكن تقدير نسبة أميلوز / أميلوبكتين من نسبة القيم الامتصاصية نانومتر 620 و 550 ومقارنتها إلى منحنى القياسية التي يتم رسم تركيزات محددة معروفة ضد القيم الاستيعاب. هذا إنتاجية عالية، وطريقة غير مكلفة هو موثوق بها وقابلة للتكرار، والسماح للتقييم أعداد كبيرة من الحيوانات المستنسخة البطاطس.

Introduction

ما يقرب من 80٪ من الوزن الطازج من درنة البطاطس هو الماء؛ كلها تقريبا من المادة الجافة المتبقية هي النشا ^1. ويتكون معظم النشا (70٪) من أميلوبكتين، في حين أن الباقي هو أميلوز. النسبة بين أميلوز والأميلوبكتين هي الخاصية الأكثر أهمية التي تؤثر على الخواص الفيزيائية للنشا. أميلوز هو خطية ألفا 1-4 سلسلة الجلوكوز، في حين أميلوبكتين هو الخطية سلسلة ألفا 1-4 مع ألفا 1-6 الفروع ^2. أساليب مثل اليود ملزمة، المسح التفاضلي قياس الكالوري (DSC)، وقد وضعت حجم عالية الأداء اللوني الاستبعاد (HPSEC) وكونكانافالين A لتحديد التفاعلات النشا في أنواع المحاصيل المختلفة ^3،4. كل بروتوكول يتطلب مهارات ومعدات خاصة، مما يجعل من الصعب تحديد مقياس يصل إلى عينات عديدة في وقت واحد. طريقة نقدم هنا هو بروتوكول تعديل من Hovenkamp-Hermelink وآخرون. ⁵ وهو الطول الموجي المزدوج اليود ملزمةطريقة تعتمد على حبيبات النشا الملون. وتشمل مزايا هذا الأسلوب في مقابل الآخرين تحديد أميلوز من النشا الخام دون تنقية وبين استخدام نظام الطول الموجي المزدوج لزيادة دقة الأسلوب ^4،6.

Protocol

1. تحديد أميلوز من درنة البطاطس نشا

1. قشر وقطع الدرنات الطازجة إلى مكعبات صغيرة.
2. وضع مكعبات البطاطا في أكياس صغيرة البني وتخزينها بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية.
3. نقل مكعبات البطاطا إلى أكياس النايلون وتجميد التجفيف.
4. بعد تجميد المجفف، طحن العينة إلى مسحوق البطاطا باستخدام قذائف هاون ومدقة أو مطحنة وايلي.
5. في أنبوب 50 مل، إضافة 20-30 ملغ من عينة درنة الأرض تجميد المجفف.
6. يعد حل 45٪ (ث / ت) وحامض البيركلوريك (مزيج 24.4 مل من حمض البيركلوريك 60٪ و 25.6 مل من الماء نقي للغاية.
7. إضافة 500 ميكرولتر من 45٪ (ث / ت) وحامض البيركلوريك ويهز أو دوامة لتفريق حبيبات النشا.
8. بعد فترة الحضانة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة 16 مل من الماء نقي للغاية في حل ومزيج من قبل vortexing.
9. بعد أن استقر المواد غير القابلة للذوبان إلى أسفل الأنبوب (في وقت لاحق 7-10 دقيقة)، ونقل 40 ميكرولتر من حل لوحة microtiter (pipetting لتجنب أي جسيمات).
10. إضافة 50 ميكرولتر من محلول اليود (2 غ + 1 غ KI I ₂ في 900 مل من الماء نقي للغاية) وتخلط العينة قبل pipetting.
11. قراءة الامتصاصية في 550 نانومتر و 620 نانومتر على الفور.
12. تحديد نسبة أميلوز بعد مقارنة نسبة أميلوز / أميلوبكتين من كل عينة (620 نانومتر الامتصاصية nm/550) مع منحنى القياسية الناتجة عن أميلوز والأميلوبكتين الحلول في مجموعة من التركيزات. وسيتم وصف هذا الإجراء المقبل. قراءة فارغة (محلول اليود وحمض البيركلوريك) جنبا إلى جنب مع عينات الاختبار. استخدام مموها البيانات للتحليلات.

2. أميلوز / أميلوبكتين المنحنى

1. في أنابيب منفصلة تزن 12.5 ملغ من أميلوز و 12.5 ملغ من أميلوبكتين.
2. إضافة إلى كل أنبوب 5 مل من 45٪ (ث / ت) وحامض البيركلوريك وتذوب تماما.
3. لكل من حلول (أميلوز والأميلوبكتين)، وجلب إلى الحجم النهائي من 50 مل مع الماء نقي للغاية.
4. مزيج 6.25مل من الأسهم أميلوز من الخطوة السابقة مع 18.75 مياه نقي للغاية مل. وهذا سيجعل حل أميلوز 6.25 ملغ / مل.
5. كرر الإجراء من أجل حل أميلوبكتين.
6. باستخدام أميلوز والحلول القياسية أميلوبكتين من الخطوات 2.4 و 2.5، وإعداد معايير أميلوز في المئة والتي هي 0-100٪ أميلوز (100-0٪ أميلوبكتين) إلى الحجم النهائي من 5 مل لإنشاء منحنى القياسية في فترات 10٪.
   على سبيل المثال، للتحضير:
   و0٪ أميلوز / 100٪ أميلوبكتين القياسية، ماصة 5 مل من محلول أميلوبكتين.
   10٪ أميلوز / 90٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 0.5 و 4.5 مل أميلوز مل حلول أميلوبكتين.
   20٪ أميلوز / 80٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 1.0 و 4.0 مل أميلوز مل حلول أميلوبكتين.
   30٪ أميلوز / 70٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 1.5 و 3.5 مل أميلوز مل حلول أميلوبكتين.
   40٪ أميلوز / 60٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 2.0 و 2.0 مل أميلوز مل حلول أميلوبكتين.
   وأميلوز 50٪/ 50٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 2.5 و 2.5 مل أميلوز مل حلول أميلوبكتين.
   60٪ أميلوز / 40٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 3.0 و 2.0 مل أميلوز مل أميلوبكتين، وهلم جرا).
7. نقل 40 ميكرولتر من كل الخليط القياسية لوحة microtiter. تشمل جيدا مع 40 ميكرولتر 45٪ (ث / ت) وحامض البيركلوريك كما فارغة.
8. إضافة 50 ميكرولتر من محلول اليود (2 غ + 1 غ KI I ₂ في 900 مل من الماء نقي للغاية) وتخلط كل عينة (بما في ذلك فارغة) من قبل pipetting.
9. قراءة absorbances في 550 نانومتر و 620 نانومتر فورا وحساب نسبة أميلوز / أميلوبكتين لكل تركيز.

النتائج

منحنى القياسية شيدت من البيانات مموها من مختلف الحلول تركيز أميلوز / أميلوبكتين يبين نسب تقريبية تتراوح الامتصاصية 0،7-1،6 (الجدول 1). ويستخدم خط الاتجاه الخطي الانحدار من هذه البيانات في وقت لاحق لاستنتاج المحتوى أميلوز في تجميد المجفف عينات البطاطا (الش?...

Discussion

المحتويات أميلوز في درنات البطاطا يتراوح عادة 20-35٪ ^7،8. إذا كان معظم القيم خارج هذا النطاق، والنظر في هذه الأخطاء المحتملة: 1) استخدمت البيانات الخام بدلا من البيانات مموها لبناء منحنى أميلوز / أميلوبكتين القياسية؛ 2) استخدمت البيانات الخام بدلا من البيانات مموها...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Amylose	Sigma	859656
Amylopectin	Sigma	A8515
Perchloric Acid 60%	Sigma	311413	Very hazardous to skin and eyes
Iodine	Sigma	23214TD
Potassium iodide	Sigma	08625JE
Equipment
Plate Reader	Bio Tek	ELx800