Определение Rapid высокую пропускную способность Амилоза в сублимированного образцов клубней картофеля

Резюме

Этот протокол описывает высокая через положить колориметрическим методом, который опирается на формирование комплекса между йодом и цепей молекул глюкозы в крахмал. Йод образует комплексы с обеих амилозы и длинных цепей внутри амилопектина. После добавления йода в образце крахмала, максимальное поглощение амилозы и амилопектина происходит при 620 и 550 нм, соответственно. Соотношение амилозы / амилопектина можно оценить из соотношения значений абсорбции нм 620 и 550 и их сравнения со стандартной кривой, при которых определенные известные концентрации показаны в зависимости от значений поглощения. Такая высокая пропускная способность, недорогой метод является надежным и воспроизводимым, позволяя оценку крупных популяций клонов картофеля.

Аннотация

Этот протокол описывает высокая через положить колориметрическим методом, который опирается на формирование комплекса между йодом и цепей молекул глюкозы в крахмал. Йод образует комплексы с обеих амилозы и длинных цепей внутри амилопектина. После добавления йода в образце крахмала, максимальное поглощение амилозы и амилопектина происходит при 620 и 550 нм, соответственно. Соотношение амилозы / амилопектина можно оценить из соотношения значений абсорбции нм 620 и 550 и их сравнения со стандартной кривой, при которых определенные известные концентрации показаны в зависимости от значений поглощения. Такая высокая пропускная способность, недорогой метод является надежным и воспроизводимым, позволяя оценку крупных популяций клонов картофеля.

Введение

Приблизительно 80% свежего веса клубней картофеля является вода, почти все из оставшегося сухого вещества составляет крахмал ^1. Большинство из крахмала (70%) состоит из амилопектина, а остаток амилозы. Соотношение между амилозы и амилопектина является наиболее важным свойством влияния на физические свойства крахмала. Амилоза представляет собой линейный альфа 1-4 цепь глюкозы, а амилопектин представляет собой линейный альфа 1-4 цепь с альфа 1-6 ветвей ^2. Методы, такие как йод связывания, дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), размер высокая производительность эксклюзионной хроматографии (HPSEC) и взаимодействия конканавалином были разработаны для определения крахмала в различных видов культур ^3,4. Каждый протокол требует специальных навыков и оборудования, что делает его трудно расширить количественно многочисленные образцы одновременно. Метод, который мы приводим здесь представляет собой модифицированный протокол от Hovenkamp-Hermelink др.. ^5, которая является двойной йода волны связыванияМетод, основанный на окрашенных гранул крахмала. Преимущества этого метода по сравнению с другими включать определение амилозы от исходного крахмала без его очистки и использование системы двойной длины волны, чтобы увеличить точность метода ^4,6.

протокол

1. Амилоза Определение от клубня картофеля крахмала

1. Очистить и нарезать свежие клубни мелкими кубиками.
2. Поместите картофель кубиками в небольших коричневых сумок и хранить в течение ночи при -80 ° С
3. Трансфер картофельные кубики на нейлоновые мешки и сублимационной сушки.
4. После сублимационной сушке, растереть картофельную образец в порошок с помощью ступки и пестика или Wiley Mill.
5. В 50 мл пробирку, добавляют 20-30 мг лиофилизированного, первый клубней образца.
6. Готовят раствор 45% (вес / объем) хлорной кислоты (смесь 24,4 мл 60%-ной хлорной кислоты и 25,6 мл сверхчистой воды.
7. Добавить 500 мкл 45% (вес / объем) хлорной кислоты и взбалтывать или его разгона крахмальных зерен.
8. После четырех минут инкубационного периода при комнатной температуре, добавить 16 мл сверхчистой воды к раствору и перемешать с помощью встряхивания.
9. После не-растворимый материал осела на дно пробирки (7-10 мин позже), передать 40 мкл раствора на планшет для микротитрования (избегая пипетирования любых частиц).
10. Добавить 50 мкл раствора йода (2 г KI + 1 г I ₂ в 900 мл сверхчистой воды) и перемешать образец с помощью пипетки.
11. Считайте абсорбцию при 550 нм и 620 нм сразу.
12. Определить процент амилозы после сравнения отношения амилоза / амилопектина каждого образца (620 нм абсорбции nm/550) с стандартной кривой, полученной из амилозы и амилопектина растворах при диапазоне концентраций. Эта процедура будет описана ниже. Читайте пустой (раствор йода и хлорной кислоты), а также испытываемых образцов. Использование отображаться данные для анализа.

2. Амилоза / амилопектина Кривая

1. В отдельные пробирки весить 12,5 мг из амилозы и 12,5 мг амилопектина.
2. Добавить в каждую пробирку 5 мл 45% (вес / объем) хлорной кислоты и полного растворения.
3. Для каждого из растворов (амилозы и амилопектина), довести до конечного объема 50 мл сверхчистой воды.
4. Смешайте 6,25мл амилозы складе с предыдущей стадии с 18,75 мл сверхчистой воды. Это сделает решение амилозы 6,25 мг / мл.
5. Повторите процедуру для амилопектинового решения.
6. Использование амилозы и амилопектина стандартных растворов с шагом 2,4 и 2,5, готовят процентов амилозы стандарты, которые 0-100% амилозы (100-0% амилопектина) до конечного объема 5 мл чтобы создать стандартную кривую в 10% интервалами.
   Например, приготовить:
   0% амилозы / 100% стандарт амилопектина, пипетки 5 мл амилопектина решение.
   10% амилозы / 90% стандартной амилопектина, объединить 0,5 мл амилозу и 4,5 мл амилопектина решения.
   20% амилозы / 80% стандартной амилопектина, объединить 1,0 мл амилозу и 4,0 мл амилопектина решения.
   30% амилозы / 70% стандартной амилопектина, объединить 1,5 мл амилозу и 3,5 мл амилопектина решения.
   40% амилозы / 60% стандарт амилопектин, комбинировать 2,0 мл амилозы и амилопектина 2,0 мл растворов.
   50% амилозы/ 50% стандартной амилопектина, объединить 2,5 мл амилозу и 2,5 мл амилопектина решения.
   60% амилозы / 40% стандарт амилопектин, комбинировать 3,0 мл амилозы и амилопектина 2,0 мл, и так далее).
7. Передача 40 мкл каждого стандартного смеси планшета для микротитрования. Включите также с 40 мкл 45% (вес / объем) хлорной кислоты в качестве заготовки.
8. Добавить 50 мкл раствора йода (2 г KI + 1 г I ₂ в 900 мл сверхчистой воды) и перемешать каждый образец (включая заготовки) с помощью пипетки.
9. Читайте абсорбцию при 550 нм и 620 нм сразу и рассчитать соотношение амилозы / амилопектина для каждой концентрации.

Результаты

Стандартная кривая построена с очищенных данных различных решений концентрационных амилозы / амилопектина показывает приблизительные коэффициенты абсорбции, начиная от 0,7 до 1,6 (табл. 1). Линейной регрессии тенденция по этим данным в дальнейшем используется для выведения сод?...

Обсуждение

Содержание амилозы в клубней картофеля обычно составляет от 20-35% ^7,8. Если большинство значения вне этого диапазона, рассмотреть эти возможные ошибки: 1) необработанные данные были использованы вместо отображаться данные для построения калибровочной кривой амилозы / амилопектина,...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Amylose	Sigma	859656
Amylopectin	Sigma	A8515
Perchloric Acid 60%	Sigma	311413	Very hazardous to skin and eyes
Iodine	Sigma	23214TD
Potassium iodide	Sigma	08625JE
Equipment
Plate Reader	Bio Tek	ELx800