קביעה המהירה amylose התפוקה גבוה בדוגמאות פקעת תפוח האדמה להקפיא יבשים

Summary

פרוטוקול זה מתאר גבוה באמצעות שיטת colorimetric לשים המסתמכת על היווצרות מורכבת בין יוד ושרשרות של מולקולות גלוקוז בעמילן. יוד יוצרת קומפלקסים עם שני amylose ושרשרות ארוכות בתוך amylopectin. לאחר התוספת של יוד לדגימת עמילן, הספיגה מקסימלית של amylose וamylopectin מתרחשת ב620 ו550 ננומטר, בהתאמה. יחס amylose / amylopectin ניתן להעריך מהיחס של ערכי ספיגת ננומטר 620 ו550 ומשווה אותם לעקומת סטנדרט שבו ריכוזים ספציפיים ידוע הם זממו נגד ערכי קליטה. תפוקה גבוהה, שיטה זולה היא אמינה לשחזור, ומאפשרת ההערכה של אוכלוסיות גדולות של שיבוטים תפוחי אדמה.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר גבוה באמצעות שיטת colorimetric לשים המסתמכת על היווצרות מורכבת בין יוד ושרשרות של מולקולות גלוקוז בעמילן. יוד יוצרת קומפלקסים עם שני amylose ושרשרות ארוכות בתוך amylopectin. לאחר התוספת של יוד לדגימת עמילן, הספיגה מקסימלית של amylose וamylopectin מתרחשת ב620 ו550 ננומטר, בהתאמה. יחס amylose / amylopectin ניתן להעריך מהיחס של ערכי ספיגת ננומטר 620 ו550 ומשווה אותם לעקומת סטנדרט שבו ריכוזים ספציפיים ידוע הם זממו נגד ערכי קליטה. תפוקה גבוהה, שיטה זולה היא אמינה לשחזור, ומאפשרת ההערכה של אוכלוסיות גדולות של שיבוטים תפוחי אדמה.

Introduction

כ 80% מהמשקל הטרי של פקעת תפוח אדמה הוא מים; כמעט את כל החומר היבש שנותר הוא עמילן ^1. רוב העמילן (70%) מורכב מamylopectin, והשאר הוא amylose. היחס בין amylose וamylopectin הוא הנכס החשוב ביותר המשפיע על התכונות הפיסיקליות של עמילן. Amylose הוא שרשרת גלוקוז ליניארי אלפא 1-4, בעוד amylopectin היא שרשרת אלפא 1-4 ליניארי עם אלפא 1-6 ענפים ^2. שיטות כגון יוד מחייבות, פער הסריקה calorimetry (DSC), כרומטוגרפיה גודל ביצועים גבוהים הדרה (HPSEC) ואינטראקציות concanavalin פותחו עבור נחישות עמילן במינים יבול שונים ^3,4. כל פרוטוקול דורש מיומנויות וציוד מיוחדים, מה שהופך את זה קשה בהיקף של עד לכמת דוגמאות רבות בכל פעם. השיטה שאנו מציגים כאן היא פרוטוקול שונה מHovenkamp-Hermelink et al. ⁵ שהוא יוד אורך גל כפולה מחייבתשיטה מבוססת על גרגרי עמילן מוכתמים. היתרונות של שיטה זו לעומת אחרים כוללים קביעת amylose מעמילן גלם ללא מטהר אותו ואת השימוש במערכת אורך הגל הכפולה כדי להגדיל את הדיוק של ^4,6 השיטה.

Protocol

1. קביעת amylose מעמילן פקעת תפוח האדמה

1. מקלפים וחותכים פקעות טריות לקוביות קטנות.
2. מניחים קוביות תפוחי אדמה בשקיות חומות קטנות ולאחסן לילה בשעה -80 ° C.
3. העבר את קוביות תפוחי אדמה לשקיות ניילון ולייבוש בהקפאה.
4. לאחר ההקפאה יבשה, לטחון את מדגם תפוחי האדמה לאבקה באמצעות מכתש ועלי או מיל ויילי.
5. בצינור 50 מיליליטר, להוסיף 20-30 מ"ג, מדגם פקעת קרקע המיובש בהקפאה.
6. הכן פתרון של 45% (w / v) חומצת perchloric (לערבב 24.4 מיליליטר של 60% חומצת perchloric ו25.6 מיליליטר של מים טהורים.
7. הוסף 500 μl של 45% (w / v) חומצת perchloric ולנער או לערבל אותו כדי לפזר גרגרי עמילן.
8. לאחר תקופת דגירה של ארבע דקות בטמפרטורת חדר, להוסיף 16 מיליליטר של מים טהורים לפתרון ומערבבים על ידי vortexing.
9. אחרי חומר שאינו מסיס יש התיישב לחלק התחתון של הצינור (7-10 דקות מאוחר יותר), להעביר 40 μl של הפתרון לצלחת microtiter (הימנעות pipetting של כל חלקיקים).
10. הוסף 50 μl של תמיסת יוד (ז 2 גרם KI + 1 ₂ ב900 מיליליטר של מים טהורים) ומערבבים את המדגם על ידי pipetting.
11. קראו את הספיגה ב 550 ננומטר ו620 מייד ננומטר.
12. לקבוע את אחוז amylose לאחר שהשווה את יחס amylose / amylopectin של כל דגימה (620 ספיגת nm/550 ננומטר) עם עקומת סטנדרט שנוצרה מפתרונות amylose וamylopectin בטווח של ריכוזים. הליך זה יתואר הבא. קראו (תמיסת יוד וחומצת perchloric) ריקות יחד עם דגימות הבדיקה. שימוש נמחק הנתונים לניתוחים.

2. Curve amylose / amylopectin

1. בצינורות נפרדים שוקלים 12.5 מ"ג amylose ו12.5 מ"ג amylopectin.
2. הוסף לכל 5 מיליליטר שפופרת של 45% (w / v) חומצת perchloric ומתמוסס לחלוטין.
3. עבור כל אחד מהפתרונות (amylose וamylopectin), מביא לנפח סופי של 50 מיליליטר עם מים טהורים.
4. מערבבים 6.25מיליליטר של מניית amylose מהשלב הקודם עם 18.75 מים טהורים מיליליטר. זה יהפוך את פתרון amylose 6.25 מ"ג / מיליליטר.
5. חזור על התהליך עבור פתרון amylopectin.
6. שימוש amylose ופתרונות סטנדרטיים amylopectin מצעדים 2.4 ו2.5, להכין את הסטנדרטים amylose אחוזים שהם amylose 0-100% (amylopectin 100-0%) לנפח סופי של 5 מיליליטר כדי ליצור עקומת הסטנדרט במרווחי 10%.
   לדוגמה, כדי להכין:
   0% amylose / 100% סטנדרטיים amylopectin, פיפטה 5 פתרון amylopectin מיליליטר.
   10% amylose / 90% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 0.5 amylose מיליליטר ו4.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
   20% amylose / 80% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 1.0 amylose מיליליטר ו4.0 מיליליטר פתרונות amylopectin.
   30% amylose / 70% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 1.5 amylose מיליליטר ו3.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
   40% amylose / 60% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 2.0 amylose מיליליטר ו2.0 מיליליטר פתרונות amylopectin.
   Amylose 50%/ 50% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 2.5 amylose מיליליטר ו2.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
   60% amylose / 40% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 3.0 amylose מיליליטר ו2.0 מיליליטר amylopectin, וכן הלאה).
7. העבר 40 μl של כל תערובת סטנדרטית לצלחת microtiter. כולל גם עם 40 μl 45% (w / v) חומצה perchloric כריקה.
8. הוסף 50 μl של תמיסת יוד (ז 2 גרם KI + 1 ₂ ב900 מיליליטר של מים טהורים) ומערבבים כל מדגם (כולל את החסר) על ידי pipetting.
9. קראו absorbances ב 550 ננומטר ו620 מייד ננומטר ולחשב את יחס amylose / amylopectin עבור כל ריכוז.

תוצאות

עקומת הסטנדרט שנבנתה מנתונים נמחקו מפתרוני ריכוז amylose / amylopectin שונים מציגה יחס הספיגה משוער נע .7-1.6 (טבלה 1). קו המגמה של רגרסיה ליניארית מנתונים אלה שימש מאוחר יותר כדי להסיק מסקנת תוכן amylose בדגימות תפוחי אדמה הקפאה יבשה (איור 1).

Discussion

תוכן amylose בפקעות תפוח אדמה בדרך כלל נע בין 20-35% ^7,8. אם רוב הערכים הם מחוץ לטווח זה, שקול שגיאות אפשריות הבאות: 1) נתונים גולמיים שימשו במקום נתונים נמחקו לבניית עקומת סטנדרט amylose / amylopectin; 2) נתונים גולמיים שימשו במקום נתונים נמחקו לקביעת amylose / יחסי amylopectin מדגימות תפוח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Amylose	Sigma	859656
Amylopectin	Sigma	A8515
Perchloric Acid 60%	Sigma	311413	Very hazardous to skin and eyes
Iodine	Sigma	23214TD
Potassium iodide	Sigma	08625JE
Equipment
Plate Reader	Bio Tek	ELx800