냉동 건조 된 감자 괴경 샘플의 신속한 높은 처리량 아밀로스 결정

요약

이 프로토콜은 요오드와 녹말 포도당 분자 사슬 사이의 복잡한의 형성에 의존 넣어 비색법을 통해 고 설명합니다. 요오드는 아밀로스와 아밀로펙틴 내 긴 사슬 모두와 복합체를 형성한다. 전분 시료에 요오드를 첨가 한 후, 아밀로오스와 아밀로펙틴의 최대 흡수는 각각 620 및 550 nm에서 발생한다. 아밀로스 / 아밀로펙틴의 비율은 620 및 550 nm의 흡광도 값의 비율을 추정하고 특정한 알려진 농도는 흡수 값에 대해 도시 된 표준 곡선에 비교를 할 수있다. 이것은 높은 처리량은, 저렴 방법은 감자 클론의 많은 개체군의 평가를 허용 신뢰성과 재현성이다.

초록

이 프로토콜은 요오드와 녹말 포도당 분자 사슬 사이의 복잡한의 형성에 의존 넣어 비색법을 통해 고 설명합니다. 요오드는 아밀로스와 아밀로펙틴 내 긴 사슬 모두와 복합체를 형성한다. 전분 시료에 요오드를 첨가 한 후, 아밀로오스와 아밀로펙틴의 최대 흡수는 각각 620 및 550 nm에서 발생한다. 아밀로스 / 아밀로펙틴의 비율은 620 및 550 nm의 흡광도 값의 비율을 추정하고 특정한 알려진 농도는 흡수 값에 대해 도시 된 표준 곡선에 비교를 할 수있다. 이것은 높은 처리량은, 저렴 방법은 감자 클론의 많은 개체군의 평가를 허용 신뢰성과 재현성이다.

서문

감자 괴경의 신선한 무게의 약 80 %가 물이며, 거의 모든 남아있는 건조 물질의 전분 ^1입니다. 나머지 동안 아밀로스 전분 (70 %)의 대부분은, 아밀로펙틴으로 구성된다. 아밀로스와 아밀로펙틴의 비율은 전분의 물성을 좌우하는 가장 중요한 속성이다. 아밀로펙틴 알파 1-6 분기 ² 선형 알파 1-4 체인 동안 아밀로스는 선형 알파 1-4 포도당 체인입니다. 요오드 등의 방법 바인딩, 시차 주사 열량계 (DSC)는, 고성능 크기 배제 크로마토 그래피 (HPSEC) 및 콘 카나 발린의 상호 작용은 다양한 작물 ^3,4 전분 판별을 위해 개발되었다. 각 프로토콜은 어려운 한 번에 다수의 샘플을 계량하는 확장 할 만드는 특별한 기술과 장비가 필요합니다. 우리가 여기서 제시하는 방법은 바인딩 듀얼 파장 요오드 Hovenkamp-Hermelink 등. ^5에서 수정 된 프로토콜입니다스테인드 전분 과립에 따라 방법. 다른 대이 방법의 장점은 정제하지 않고 원료 전분 아밀로스 판별 및 메서드 ^4,6의 정밀도를 높이기 위해 이중 파장 시스템의 사용을 포함한다.

프로토콜

1. 감자 덩이 식물의 전분에서 아밀로오스 결정

1. 껍질과 작은 큐브로 신선한 덩이 줄기를 잘라.
2. 작은 갈색 봉투에 감자 큐브를 놓고 C. -80 °에서 하룻밤 저장
3. 나일론 가방과 동결 건조 감자 조각을 전송합니다.
4. 동결 건조 후, 박격포와 유 봉 또는 와일리 밀을 사용하여 분말로 감자 샘플을 갈기.
5. 50 ㎖ 튜브에, 동결 건조, 지상 괴경 20-30 mg의 샘플을 추가한다.
6. 45 %의 솔루션을 준비합니다 (w / v)의 과염소산 (60 % 과염소산 24.4 ㎖ 및 초순수 25.6 ㎖를 혼합한다.
7. 45 %의 500 μL (w / v)의 과염소산을 추가하고 흔들거나 전분 과립을 분산 할 소용돌이 친다.
8. 실온에서 네 분 배양 기간 후, 용액을 초순수 16 ㎖를 추가하고 텍싱하여 혼합한다.
9. 비 수용성 물질이 튜브 바닥에 침전 한 후 (7-10 분 이상), (마이크로 타이 터 플레이트에 용액 40 μl를 전송할모든 입자의 피펫 팅을 피하는).
10. 요오드 용액 ​​(2g KI + 1g의 I 초순수 900 ㎖를 _2)의 50 μl를 추가하고 피펫 팅하여 샘플을 섞는다.
11. 550 nm에서 흡광도를 읽고 (620)는 즉시 nm의.
12. 의 농도 범위에서 아밀로스 및 아밀로펙틴 해법에서 생성 표준 곡선과 각 샘플의 아밀로스 / 아밀로펙틴의 비율 (620 nm/550 nm의 흡광도)를 비교하여 아밀로스 비율을 결정한다. 이 절차는 다음에 설명 될 것이다. 테스트 샘플과 함께 빈 (요오드 용액과 과염소산)를 참조하십시오. 사용 분석을위한 데이터를 숨겨진.

2. 아밀로스 / 아밀로펙틴 곡선

1. 별도의 튜브에서 아밀로오스의 12.5 MG와 아밀로펙틴의 12.5 mg의 무게.
2. 45 %의 각 튜브 5 ㎖에 추가 (W / V) 과염소산 완전히 용해.
3. 솔루션 (아밀로오스 및 아밀로펙틴) 각각에 대해 초순수 50 ㎖의 최종 부피로 가져온다.
4. 6.25 혼합20,625 ML 초순수 사용하여 이전 단계에서 아밀로오스 주식의 ML. 이것은 6.25 ㎎ / ㎖의 아밀로스 솔루션을 만들 것입니다.
5. 아밀로펙틴 솔루션에 대해이 절차를 반복합니다.
6. 단계 2.4 및 2.5에서 아밀로스 및 아밀로펙틴 표준 용액을 사용하여, 10 % 간격의 표준 곡선을 생성하기 위해 5 ㎖의 최종 부피로 0 ~ 100 %의 아밀로오스 (100~0% 아밀로펙틴) 아르 %의 아밀로스 표준 제조.
   예를 들어, 제조 하였다 :
   0 % 아밀로오스 / 100 % 아밀로펙틴 표준 피펫 5 ㎖ 아밀로펙틴 솔루션입니다.
   10 %의 아밀로스 / 90 % 아밀로펙틴 표준은 0.5 ㎖ 아밀로스와 아밀로펙틴의 4.5 ml의 용액을 배합.
   20 %의 아밀로스 / 80 % 아밀로펙틴 표준은 1.0 ml의 아밀로스와 아밀로펙틴의 4.0 ml의 용액을 배합.
   30 % 아밀로오스 / 70 % 아밀로펙틴 표준은 1.5 ml의 아밀로오스와 아밀로펙틴 3.5 ml의 솔루션을 결합한다.
   40 %의 아밀로오스 / 60 % 아밀로펙틴 표준은 2.0 ml의 아밀로오스와 아밀로펙틴 2.0 ml의 솔루션을 결합한다.
   50 %의 아밀로오스/ 50 % 아밀로펙틴 표준, 2.5 ml의 아밀로오스와 아밀로펙틴 2.5 ml의 솔루션을 결합한다.
   60 %의 아밀로스 / 40 % 아밀로펙틴 표준은 3.0 ml의 아밀로스 및 아밀로펙틴을 2.0 ㎖의 결합 등).
7. 마이크로 플레이트에 각각의 표준 혼합물의 40 μl를 전송합니다. 빈으로 잘 40 ㎕의 45 %와 (w / v)의 과염소산 (가) 있습니다.
8. 요오드 용액 ​​(2g KI + 1g의 I 초순수 900 ㎖를 _2)의 50 μl를 추가하고 피펫으로 (공백 포함) 각 샘플을 섞는다.
9. 550 nm에서 흡광도를 읽고 (620)는 즉시 nm의 각 농도에 대한 아밀로오스 / 아밀로펙틴의 비율을 계산합니다.

결과

다른 아밀로오스 / 아밀로펙틴 농도 솔루션의 숨겨진 데이터를 구축 표준 곡선은 0.7에서 1.6 (표 1)에 이르기까지 약 흡수 비율을 보여줍니다. 이러한 데이터로부터 선형 회귀 추세선 나중에 동결 건조 감자 샘플 아밀로스 함량 (도 1)를 추론하는 데 사용된다.

공장의 생산 환경은 감자 괴경 ⁷ 아밀로스 함량에 대한 몇 가지 효과가 있습니다. 두...

토론

감자 괴경의 아밀로스 함량은 일반적으로 20 ~ 35 % ^7,8 범위. 가장 값이 범위를 벗어나는 경우, 이러한 오류 가능성 고려 : 1) 원시 데이터가 아밀로오스 / 아밀로펙틴 표준 곡선의 건설 대신 숨겨진 데이터를 사용했다가, 2) 원시 데이터는 아밀로오스의 결정 대신에 숨겨진 데이터를 사용 하였다 / 아밀로펙틴 감자 샘플에서 비율, 또는 3) 해석에 사용하는 물이 충분히 순수하지 않았다. 우리?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Amylose	Sigma	859656
Amylopectin	Sigma	A8515
Perchloric Acid 60%	Sigma	311413	Very hazardous to skin and eyes
Iodine	Sigma	23214TD
Potassium iodide	Sigma	08625JE
Equipment
Plate Reader	Bio Tek	ELx800