Freeze Kurutulmuş Patates Yumru Örnekleri Hızlı Yüksek Verimli Amilozlu Belirlenmesi

Özet

Bu protokol, iyot ve nişastadan glukoz moleküllerinin zincirleri arasında bir kompleks oluşumuna dayanır koymak kolorimetrik yöntem sayesinde yüksek tarif etmektedir. İyot amiloz ve amilopektin içinde uzun zincirleri hem de kompleksler oluşturur. Bir nişasta örnek iyot ilave edildikten sonra, amiloz ve amilopektin maksimum emme, sırasıyla, 620 ve 550 nm'de meydana gelmektedir. Amiloz / amilopektin oranının 620 ve 550 nm absorbans değerlerinin oranından tahmin edilir ve belirli bir bilinen konsantrasyonları emme değerlerine karşı grafiğe dökülmektedir edildiği bir standart eğri ile mukayese edilebilir. Bu yüksek verimlilik, ucuz bir yöntem patates klonları geniş popülasyonların değerlendirilmesini sağlayan, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Özet

Bu protokol, iyot ve nişastadan glukoz moleküllerinin zincirleri arasında bir kompleks oluşumuna dayanır koymak kolorimetrik yöntem sayesinde yüksek tarif etmektedir. İyot amiloz ve amilopektin içinde uzun zincirleri hem de kompleksler oluşturur. Bir nişasta örnek iyot ilave edildikten sonra, amiloz ve amilopektin maksimum emme, sırasıyla, 620 ve 550 nm'de meydana gelmektedir. Amiloz / amilopektin oranının 620 ve 550 nm absorbans değerlerinin oranından tahmin edilir ve belirli bir bilinen konsantrasyonları emme değerlerine karşı grafiğe dökülmektedir edildiği bir standart eğri ile mukayese edilebilir. Bu yüksek verimlilik, ucuz bir yöntem patates klonları geniş popülasyonların değerlendirilmesini sağlayan, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Giriş

Bir patates yumru taze ağırlığının, yaklaşık% 80 su, hemen hemen tüm kalan kuru maddenin nişasta ^1'dir. Kalan amiloz ise nişasta (% 70) çoğu, amilopektin oluşmaktadır. Amiloz ve amilopektin arasındaki oran nişastanın fiziksel özelliklerini etkileyen en önemli özelliktir. Amilopektin alfa 1-6 dalları ² olan bir doğrusal zincirli alfa 1-4 iken, amiloz, lineer alfa 1-4 glukoz zinciridir. Örneğin iyot gibi bağlama yöntemleri, diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC), yüksek performanslı boyut dışlama kromatografisi (HPSEC) ve konkanavalin A etkileşimleri farklı bitki türlerinde ^3,4 in nişasta tayini için geliştirilmiştir. Her protokol zor bir anda çok sayıda örnekleri ölçmek büyütmek için yapım, özel beceri ve ekipman gerektirir. Burada mevcut yöntem, bağlayıcı bir dual dalga boyu iyottur Hovenkamp-Hermelink et ^{al., 5'den} değiştirilmiş bir protokoldürlekeli nişasta granüllerinin dayanan yöntem. Diğerleri karşı Bu yöntemin avantajı, temizleme olmadan ham nişastadan amiloz kararlılık ve yöntem ^4,6 hassasiyetini artırmak için ikili dalga boyu sisteminin kullanımını içerir.

Protokol

1.. Patates yumru Starch'tan Amiloz belirlenmesi

1. Peel ve küçük küpler halinde taze yumrular kesti.
2. Küçük kahverengi torbalarda patates küpleri koyun ve -80 ° C'de gece boyunca depolamak
3. Naylon torba ve dondurarak kurutma için patates küpleri aktarın.
4. Dondurularak kurutulduktan sonra, harç ve havan tokmağı ve bir Wiley değirmen kullanılarak toz haline öğütmek patates örnek.
5. 50 ml'lik bir tüp içinde, dondurularak kurutulmuş, öğütülmüş yumru örneğin 20-30 mg ekleyin.
6. % 45 oranında bir solüsyonu hazırlayın (ağ / h) perklorik asit (% 60 perklorik asit 24.4 ml ve ultra-saf su 25,6 ml karıştırın.
7. % 45 500 ul (ağ / hac) perklorik asit ilave edin ve çalkalayın veya nişasta granüllerinin dağıtmak için girdap.
8. Oda sıcaklığında dört dakikalık bir inkübasyon süresinden sonra, çözeltiye ultra-saf su ekleyin ve 16 ml vorteks ile karıştırın.
9. Çözünür olmayan madde, tüp dibine yerleşmiş sonra (7-10 dakika sonra), (a mikrotiter plakaya çözeltisi 40 ul transferHerhangi bir parçacık pipetleme kaçınarak).
10. Iyot çözeltisi (2 g + 1 g KI I ultra-saf su 900 ml ₂₎ 50 ul ekle ve pipetleme örnek karıştırın.
11. 550 nm'de absorbans okuma ve hemen 620 nm.
12. Bir konsantrasyon aralığında amiloz ve amilopektin çözeltilerinden oluşturulan standart bir eğri ile her bir numunenin amiloz / amilopektin oranının (620 nm/550 nm absorbans) karşılaştırarak sonra amiloz yüzdesini belirlemek. Bu işlem aşağıda tarif edilecektir. Test örnekleri ile birlikte boş (iyot çözeltisi ve perklorik asit) okuyun. Kullanım analizler için veri blanked.

2. Amiloz / amilopektin Eğrisi

1. Ayrı tüpler içinde amiloz 12.5 mg ve 12.5 mg amilopektin tartın.
2. % 45 her bir tüp, 5 ml ekle (ağ / hac) perklorik asit ve tamamen çözülür.
3. Çözeltilerin (amiloz ve amilopektin) her biri için, ultra-saf su ile 50 ml lik bir son hacme getirmek.
4. 6.25 Mix18.75 ml ultra saf su ile önceki adımdaki amiloz stoklar ml. Bu bir 6.25 mg / ml amiloz çözüm sağlayacaktır.
5. Amilopektin çözüm için prosedürü tekrarlayın.
6. Adım 2.4 ve 2.5 arasındaki amiloz ve amilopektin standart çözüm kullanılarak,% 10 aralıklarla, standart eğri oluşturmak için 5 ml'lik bir nihai hacme kadar% 0-100 amiloz (100-0% amilopektin) olan yüzde amiloz standartlar hazırlandı.
   Örneğin hazırlanması için:
   0% amiloz /% 100 amilopektin standart pipet 5 ml amilopektin çözüm.
   % 10 amiloz /% 90 amilopektin standart, 0.5 ml amiloz ve amilopektin 4.5 ml çözüm birleştirir.
   % 20 amiloz /% 80 amilopektin standart, 1.0 ml amiloz ve amilopektin 4,0 ml çözümler birleştirir.
   % 30 amiloz /% 70 amilopektin standart, 1.5 ml amiloz ve amilopektin 3.5 ml çözüm birleştirir.
   % 40 amiloz /% 60 amilopektin standart, 2.0 ml amiloz ve amilopektin 2.0 ml çözüm birleştirir.
   % 50 amiloz/% 50 amilopektin standart, 2.5 ml amiloz ve amilopektin 2.5 ml çözüm birleştirir.
   % 60 amiloz /% 40 amilopektin standart, 3.0 ml amiloz ve amilopektin 2.0 ml birleştirmek, ve benzeri).
7. Bir mikrotitre plakasının her bir standart karışımın 40 ul aktarın. Boş olarak iyi olarak 40 ul% 45 (ağ / hac) perklorik asit içerir.
8. Iyot çözeltisi (2 g + 1 g KI I ultra-saf su 900 ml ₂₎ 50 ul ekle ve pipetleme (boş dahil) her bir örnek karıştırın.
9. 550 nm'de absorbans okuma ve hemen 620 nm ve her bir konsantrasyon için amiloz / amilopektin oranının hesaplanması.

Sonuçlar

Farklı amiloz / amilopektin konsantrasyon çözümler boşaltılır veriler kullanılarak oluşturulmuştur Standart eğri, 0.7 ila 1.6 (Tablo 1) arasında değişen yaklaşık absorbans oranlarını göstermektedir. Bu verilerden bir lineer regresyon eğilim çizgi daha sonra dondurularak kurutuldu, patates örneklerinde amiloz içeriği (Şekil 1) çıkarım için kullanılır.

Bitki Üretim ortamında patates yumru ⁷ amiloz içeriği üzerinde...

Tartışmalar

Patates yumruları içinde amiloz içeriği tipik olarak% 20-35 ^7,8 arasında değişir. En Değerler bu aralığın dışında olursa, bu olası hataları göz önünde bulundurun: 1) ham veri amiloz / amilopektin, standart eğrisinin oluşturulması için kesilmesinin yerine veri kullanılmıştır, 2) ham veri amiloz belirlenmesi için yerine boşaltılır verileri kullanılmıştır / amilopektin patates örneklerinden oranları veya 3) Analiz için kullanılan su yeterince saf değildi. Bu analizde disti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Amylose	Sigma	859656
Amylopectin	Sigma	A8515
Perchloric Acid 60%	Sigma	311413	Very hazardous to skin and eyes
Iodine	Sigma	23214TD
Potassium iodide	Sigma	08625JE
Equipment
Plate Reader	Bio Tek	ELx800