Rapides à haut débit amylose Détermination dans lyophilisé échantillons de pommes de terre de tubercules

Résumé

Ce protocole décrit un procédé colorimétrique haut à travers mettre qui repose sur la formation d'un complexe entre l'iode et les chaînes de molécules de glucose de l'amidon. Iode forme des complexes avec les deux amylose et l'amylopectine dans de longues chaînes. Après l'addition d'iode à un échantillon d'amidon, l'absorption maximale de l'amylose et de l'amylopectine se produit à 620 et 550 nm, respectivement. Le ratio amylose / amylopectine peut être estimé à partir du rapport des valeurs d'absorbance 620 nm et 550 et en les comparant à une courbe standard dans laquelle les concentrations connues spécifiques sont tracées en fonction des valeurs d'absorption. Ce débit élevé, méthode peu coûteuse est fiable et reproductible, permettant l'évaluation des grandes populations de clones de pommes de terre.

Résumé

Ce protocole décrit un procédé colorimétrique haut à travers mettre qui repose sur la formation d'un complexe entre l'iode et les chaînes de molécules de glucose de l'amidon. Iode forme des complexes avec les deux amylose et l'amylopectine dans de longues chaînes. Après l'addition d'iode à un échantillon d'amidon, l'absorption maximale de l'amylose et de l'amylopectine se produit à 620 et 550 nm, respectivement. Le ratio amylose / amylopectine peut être estimé à partir du rapport des valeurs d'absorbance 620 nm et 550 et en les comparant à une courbe standard dans laquelle les concentrations connues spécifiques sont tracées en fonction des valeurs d'absorption. Ce débit élevé, méthode peu coûteuse est fiable et reproductible, permettant l'évaluation des grandes populations de clones de pommes de terre.

Introduction

Environ 80% du poids frais d'un tubercule de pomme de terre est de l'eau; la quasi-totalité de la matière sèche restante est l'amidon ^1. La plupart de l'amidon (70%) est composé d'amylopectine, tandis que le reste est de l'amylose. Le rapport entre l'amylose et l'amylopectine est la propriété la plus importante influence sur les propriétés physiques de l'amidon. L'amylose est un alpha 1-4 chaîne linéaire de glucose, tandis que l'amylopectine est un linéaire alpha 1-4 chaîne alpha 1-6 branches ^2. Des méthodes telles que la liaison de l'iode, calorimétrie différentielle à balayage (DSC), la Chromatographie d'exclusion stérique haute performance (HPSEC) et les interactions de la concanavaline A a été développée pour la détermination de l'amidon de différentes espèces de plantes cultivées ^3,4. Chaque protocole exige des compétences et des équipements spéciaux, ce qui rend difficile à l'échelle à quantifier de nombreux échantillons à la fois. La méthode que nous présentons ici est un protocole modifié à partir de Hovenkamp-Hermelink et al. ^5, qui est une longueur d'onde double liaison de l'iodeméthode basée sur les granules d'amidon colorés. Les avantages de ce procédé par rapport à d'autres comprennent la détermination de la teneur en amylose de l'amidon brut sans le purifier et l'utilisation du système à double longueur d'onde pour augmenter la précision de la méthode ^4,6.

Protocole

Une. Détermination de la pomme de terre amylose Tuber amidon

1. Peler et couper les tubercules frais en petits cubes.
2. Placez les cubes de pommes de terre dans de petits sacs bruns et stocker pendant une nuit à -80 ° C.
3. Transfert cubes de pommes de terre dans des sacs de nylon et de lyophilisation.
4. Après lyophilisé, broyer l'échantillon de pommes de terre en poudre en utilisant un mortier et un pilon ou un broyeur Wiley.
5. Dans un tube de 50 ml, ajouter 20 à 30 mg de l'échantillon de sol tubercule lyophilisée.
6. Préparer une solution de 45% (p / v) d'acide perchlorique (mélange 24,4 ml d'acide perchlorique à 60% et 25,6 ml d'eau ultra-pure.
7. Ajouter 500 ul de 45% (p / v) d'acide perchlorique et secouer ou agiter pour disperser les granules d'amidon.
8. Après une période d'incubation de quatre minutes à la température ambiante, ajouter 16 ml d'eau ultra-pure à la solution et mélanger au vortex.
9. Après matériau non soluble a déposé au fond du tube (7-10 min plus tard), transférer 40 pi de la solution sur une plaque de microtitration (éviter le pipetage de toutes les particules).
10. Ajouter 50 ul de solution d'iode (KI à 2 g + 1 g _d'I2 dans 900 ml d'eau ultra-pure) et mélanger l'échantillon par pipettage.
11. Lire l'absorbance à 550 nm et 620 nm immédiatement.
12. Déterminer le pourcentage d'amylose après comparaison du rapport amylose / amylopectine de chaque échantillon (620 nm/550 nm l'absorbance) avec une courbe standard générée à partir de solutions d'amylose et d'amylopectine dans une gamme de concentrations. Cette procédure sera maintenant décrit. Lire l'ébauche (solution d'iode et de l'acide perchlorique) en même temps que les échantillons d'essai. Utilisation blanchi données pour les analyses.

2. Amylose / amylopectine Curve

1. Dans des tubes séparés pèsent 12,5 mg de l'amylose et de l'amylopectine 12,5 mg.
2. Ajouter à chaque tube 5 ml de 45% (p / v) d'acide perchlorique et se dissoudre complètement.
3. Pour chacune des solutions (amylose et amylopectine), amener à un volume final de 50 ml avec de l'eau ultra-pure.
4. Mélanger 6,25ml de stock amylose de l'étape précédente avec 18,75 ml d'eau ultra-pure. Cela fera une solution d'amylose 6,25 mg / ml.
5. Répétez la procédure pour la solution de l'amylopectine.
6. Utilisation de l'amylose et des solutions standard de l'amylopectine à partir des étapes 2,4 et 2,5, préparer des normes de teneur en amylose de 0 à 100 pour cent qui sont des% d'amylose (100-0% d'amylopectine) à un volume final de 5 ml pour créer la courbe d'étalonnage à des intervalles de 10%.
   Par exemple, pour préparer:
   L'amylose / 100% d'amylopectine-type de 0%, une pipette 5 ml de solution d'amylopectine.
   L'amylose / 90% d'amylopectine norme de 10%, mélanger 0,5 ml 4,5 ml d'amylose et d'amylopectine solutions.
   L'amylose / 80% d'amylopectine norme de 20%, mélanger 1,0 ml 4,0 ml d'amylose et d'amylopectine solutions.
   L'amylose / 70% de la norme de 30% d'amylopectine, de l'amylose combiner 1,5 ml et 3,5 ml des solutions d'amylopectine.
   L'amylose / 60% de la norme de 40% d'amylopectine, de l'amylose combiner 2,0 ml et 2,0 ml des solutions d'amylopectine.
   Le 50% d'amylose/ 50% d'amylopectine norme, mélanger 2,5 ml 2,5 ml d'amylose et d'amylopectine solutions.
   L'amylose / 40% de la norme de 60% d'amylopectine, de l'amylose combiner 3,0 ml et 2,0 ml d'amylopectine, et ainsi de suite).
7. Transférer 40 pl de chaque mélange standard à une plaque de microtitration. Inclure un puits avec 40 ul de 45% (p / v) d'acide perchlorique le vide.
8. Ajouter 50 ul de solution d'iode (KI à 2 g + 1 g _d'I2 dans 900 ml d'eau ultra-pure) et mélanger chacun des échantillons (y compris le blanc) par pipetage.
9. Lire les absorbances à 550 nm et 620 nm immédiatement et calculer le rapport amylose / amylopectine pour chaque concentration.

Résultats

La courbe d'étalonnage construite à partir des données masquées de différentes solutions de concentration amylose / amylopectine montre ratios d'absorbance approximatif allant de 0,7 à 1,6 (Tableau 1). Une ligne de tendance de régression linéaire à partir de ces données sont ensuite utilisées pour déduire la teneur en amylose dans lyophilisés échantillons de pommes de terre (figure 1).

L'environnement de production de l'usine a ...

Discussion

La teneur en amylose dans les tubercules de pomme de terre est généralement comprise entre 20-35% ^7,8. Si la plupart des valeurs sont en dehors de cette gamme, tenir compte de ces erreurs possibles: 1) les données brutes ont été utilisés à la place des données masquées pour la construction de la courbe standard amylose / amylopectine; 2) les données brutes ont été utilisés à la place des données masquées pour la détermination de la teneur en amylose ratios / amylopectine à partir des échant...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Amylose	Sigma	859656
Amylopectin	Sigma	A8515
Perchloric Acid 60%	Sigma	311413	Very hazardous to skin and eyes
Iodine	Sigma	23214TD
Potassium iodide	Sigma	08625JE
Equipment
Plate Reader	Bio Tek	ELx800