A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
الأنف الثدييات هو جهاز متعدد الوظائف مع الهياكل الداخلية المعقدة. واصطف تجويف الأنف مع مختلف ظهائر مثل ظهائر حاسة الشم والجهاز التنفسي، والحرشفية التي تختلف بشكل ملحوظ في المواقع التشريحية، مورفولوجيا، ووظائفها. في فئران بالغة، ويتم تغطية الأنف مع مختلف عظام الجمجمة، مما يحد من وصول التجريبية إلى الهياكل الداخلية، خصوصا تلك الموجودة في تلك الخلفية كما الظهارة الشمية الرئيسية (وزارة التربية). نحن هنا وصف وسيلة فعالة للحصول على ما يقرب من الأنسجة الأنفية كامل وسليمة مع منظمة التشريحية الحفاظ عليها. باستخدام أدوات جراحية تحت مجهر تشريح، ونحن بشكل تسلسلي إزالة عظام الجمجمة المحيطة الأنسجة الأنفية. يمكن تنفيذ هذا الإجراء على حد سواء، ورؤساء الماوس البشرة بارافورمالدهيد ثابتة وتشريح طازجة. الإجراء deboning كامل يستغرق حوالي 20-30 دقيقة، والذي هو أقصر بكثير من الوقت التجريبية اللازمة لدي التقليدية القائمة على المواد الكيميائيةتكلس. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم وسيلة سهلة لإزالة فقاعات الهواء المحبوس بين القرائن، وهو أمر حاسم للحصول على أجزاء متصلة أفقيا أو الاكليلية أو السهمي رقيقة من إعداد الأنسجة الأنفية. الأنسجة الأنفية إعدادها باستخدام طريقة لدينا يمكن استخدامها لمراقبة كامل جبل من ظهائر بأكمله، فضلا عن المورفولوجية، immunocytochemical، RNA التهجين في الموقع، والدراسات الفسيولوجية، وخاصة في الدراسات حيث منطقة محددة الفحص والمقارنة هي من الفائدة.
تجويف الأنف الثدييات يحتوي على أنواع مختلفة من الأنسجة والأجهزة التي تخدم وظائف متميزة. تجويف الأنف تشكل جزء من دخول الجهاز التنفسي العلوي، والذي يسمح السفر الجوي من وإلى الرئتين. استنشاق الهواء يمر عبر تجويف الأنف حيث يخضع لدرجة الحرارة والرطوبة تكييف 1 وكذلك تنظيف أو تصفية لإزالة المواد المهيجة والسامة والكائنات الحية الدقيقة المعدية 2. يتم تنفيذ كل من العلاجات بها الأنف ظهائر والأنسجة تحت الظهارة، بما في ذلك الغدد والأوعية وحاسمة لحماية الشعب الهوائية السفلى والرئتين. بالإضافة إلى دورها في التنفس والدفاع الظهارية، يحتوي على أنسجة الأنف أيضا الأجهزة الحسية الطرفية للأنظمة حاسة الشم والعصب الثلاثي التوائم، الذي كشف عن مجموعة واسعة من المواد الكيميائية في الهواء يمر. اعتمادا على أي نظام يتم تنشيط والكشف الحسي للمواد الكيميائية في الأنف يمكن أن تثير إماوحاسة الشم، وتهيج، أو ألم 3،4.
نظام حاسة الشم الطرفية معقدة وتتكون من عدة مفصولة تشريحيا الحواس حاسة الشم داخل تجويف الأنف. فيما بينها، والظهارة الشمية الرئيسية (وزارة التربية) هو أكبر، والتي تشكل ما يقرب من 45-52٪ من ظهائر الأنف في القوارض (5) ويقع في المنطقة الخلفية. في المنطقة أمامي بطني، وهناك زوج من تركيبات أنبوبية المعروفة باسم الجهاز الميكعي 6، الذي يجلس على طول كل جانب من الحاجز الأنفي. مجموعتين إضافية صغيرة من الخلايا العصبية الحسية الشمية، والمعروفة باسم الجهاز الحاجز من ماسيرا 7،8 والعقدة Gruneberg 9، يقيمون على طول الحاجز البطني والمنطقة الظهرية من دخول تجويف الأنف، على التوالي. هذه الأجهزة الطرفية العصبية تحتوي على ظهائر مع السمات المميزة في التشكل والتعبير علامة الخلية، وظيفة فسيولوجية. معا أنها الكشف عن الآلاف من رائحةالجزيئات مع مجموعة رائعة وحساسية 10-12.
بالإضافة إلى الأجهزة الحسية الشمية، تجويف الأنف أيضا يضم أنظمة الحسية الأخرى. ومن المعروف أن ببتيدي المفعول الألياف العصبية مثلث التوائم موجودة في الظهارة الأنفية، وخصوصا ظهارة التنفسي 13،14. بعض من هذه الألياف كشف المواد الكيميائية المهيجة والسامة، وهي المسؤولة عن الشروع في ردود الافعال واقية مثل السعال والعطس 4،15. ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن مركبات معطر ومريرة مزعجة من قبل اكتشفت مؤخرا السكان من الخلايا حسي كيميائي الانفرادي (SCCS)، وكثير منها يتم معصب بواسطة الألياف العصبية مثلث التوائم 16-19. وتقع هذه SCCS في كثافة العالي في المنطقة من دخول تجويف الأنف والقنوات دخول الميكعي، ملمحا الى انه قد تخدم أيضا وظيفة وقائية 16-18. وبالتالي، يمكن أن الأنف ظهائر تختلف اختلافا جوهريا في وظيفة، مورفولوجيا، وتكوين الخلية اعتمادا على هممواقع التشريحية.
حتى داخل الظهارة واحدة والمتخصصة، وهناك اختلافات إقليمية. وزارة التربية والتعليم هو أحد الأمثلة على ذلك. خطوط زارة التربية والتعليم مختلف القرائن، التي هي معقدة وكرة لولبية الهياكل. بسببهم، مناطق مختلفة من تجربة وزارة التربية مختلف معدلات تدفق الهواء، وبالتالي، معدلات إزالة جزيئات رائحة المحمولة جوا 20 نشر مختلفة و. أيضا، فمن المعروف أن الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSNs) تعبر عن مستقبلات الرائحة نظرا تقع في واحدة من أربع مناطق التحايل من وزارة التربية 21،22. كيف يؤثر هذا الاختلاف الموقع استجابة لOSN لعطور وإلى حد كبير غير معروفة. وبالإضافة إلى ذلك، بعض السكان OSN يحمل تفضيل الإقليمية. OSNs غوانيليل محلقة-D (GC-D)، معربا عن ديها توزيعات منطقتين لصالح المناطق طريق مسدود دي الكيس من ectoturbinates 23،24. وفي الآونة الأخيرة، وجدنا جزء من السكان من OSNs الكنسي الذي يعبر عابر مستقبلات المحتملة قناة M5 (TRPM5) ويقع تفضيلي في المناطق الجانبية وبطني 25. هذه النتائج تشير إلى أن وزارة التربية ليست موحدة. ولكن، كيف تؤثر هذه الاختلافات الإقليمية الترميز حاسة الشم ليست مفهومة. هذا هو في جزء منه لأن التحقيق الفسيولوجية شامل من وزارة التربية والأنف كان محدودا بسبب صعوبة الحصول على حالها الأنف ظهائر مع منظمة التشريحية المحفوظة باستخدام الأساليب الحالية.
ويحيط الأنف ظهائر في الغالب من قبل العظام الأمامي من الجمجمة، بما في ذلك الأنف، الفك العلوي، الحنكي، الوجني، وعظام الغربالي. في فئران بالغة ونماذج القوارض الأخرى، هذه العظام هي شاقة وصعبة لإزالة دون الإضرار الأنسجة الأنفية مرتبطة ارتباطا وثيقا، ولا سيما القرائن دقيق. في كثير من الأحيان، يتم استخدام زوال الكلس القائمة على المواد الكيميائية لتليين العظام للسماح cryosectioning من الأنسجة الأنفية للالمورفولوجية، المناعى، والدراسات التهجين في الموقع، ولكن depenقرع على عمر الحيوان، ويمكن أن تستمر عملية إزالة الكلس بين عشية وضحاها يصل إلى 7 أيام 24،26-28. يتم هذا العلاج محدودة أيضا لأنه يتطلب أن تكون الأنسجة تثبيتي الحفاظ عليها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إزالة الكلس الكيميائية أن تكون قاسية وتؤثر على الوسم المناعي من بعض الأجسام المضادة الحساسة 29،30. الدراسات الفسيولوجية، مطلوب الأنسجة الحية، وبالتالي، وكثيرا ما تجرى هذه التجارب في OSNs معزولة أو شرائح زارة التربية والتعليم التي تم الحصول عليها من حديثي الولادة الذين هم رقيقة وناعمة 17،31،32 عظام الجمجمة. يمكن أيضا الاستفادة من الدراسات الفسيولوجية الاستعدادات جبل بأكمله عن طريق تقسيم رأس 25،33،34، ولكن عادة فقط على السطح الإنسي من الأنف يمكن الوصول إليه بسهولة، مما يحد من التسجيلات الفسيولوجية على مجالات أخرى.
هنا، نحن تصف، طريقة deboning دليل فعالة لإعداد الأنسجة الأنفية سليمة مع الحفاظ على منظمة التشريحية الأصلي والتشكل. نحن بالتسلسل إزالة العظام الرئيسية للالأماميوهناك حاجة الجمجمة تحت المجهر تشريح لفضح ظهارة الأنفية سليمة تماما تقريبا مع الحفاظ على العظام المحارة رقيقة سليمة إلا إذا كانت الفئران هي قديمة جدا وcryosectioning. ونعرب أيضا عن طريقة للحفاظ على العلاقة بين الأنسجة الأنفية وبصيلات الشم، فضلا عن بقية الدماغ، مما يسهل الفحص المتزامن للدوائر كلا الطرفية والمركزية. لدينا وسيلة يمكن استخدامها لإعداد بارافورمالدهيد ثابتة، وكذلك الطازجة، والأنسجة الأنفية الحية. وبالتالي، من المتوقع لدينا وسيلة لتسهيل الدراسات المورفولوجية، المناعى والفسيولوجية للتنفس، الشم، والأنف الضرر والمرض.
1. الماوس إعداد الأنف
كنا الكبار C57BL / 6 الفئران الخلفية في هذه الدراسة. تمت الموافقة على جميع الرعاية والإجراءات الحيوانية رعاية الحيوان واللجان الاستخدام (IACUC) من جامعة ميريلاند، مقاطعة بالتيمور.
1.1 الحصول على الأنف من الفئران paraformaldahyde ثابت
الشكل 1. عظام جمجمة فأر A: شاهد الظهري للجمجمة B: عرض بطني من الجمجمة مع الفك السفلي إزالتها. وقد أعد الجمجمة من الماوس القديمة 40 يوما. يتم تلوين العظام الفردية لأفضل تصور. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
1.2 الحصول على الأنف من الفئران الموت الرحيم طازجة
2. القاطعة، الأمامي الميكعة وإزالة العظام الفك
3. عظم الأنف والظهرية الوجني إزالة اللوحة
4. الجانبي الوجني إزالة اللوحة
5. إزالة العظام المدار
6. إزالة عظم الغربالي
> 7. إعداد الأنف لCryosectioning
باستخدام هذه الطريقة، يمكننا الحصول بشكل موثوق الأنسجة الأنفية تقريبا سليمة تماما. ويبين الشكل 2A صورة عينة الأنف الكبار من رئيس بارافورمالدهيد ثابتة. في هذه العينة، وجميع الأجهزة الحسية الشمية الفرعية الأربعة، بما في ذلك وزارة التربية، الجهاز الحاجز، الع?...
هنا، أثبتنا إجراء خطوة بخطوة لعزل الأنسجة حاسة الشم والجهاز التنفسي سليمة من الأنف الماوس عن طريق إزالة بالتتابع العظام المحيطة في حين أن يجنب الأنسجة أدناه. وتبين لنا أن إزالة العظام دقيق يمكن الحفاظ حتى على الأنسجة الأكثر حساسية في مجملها. نحن أيضا نشارك نظرة ثاقب?...
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة للبحوث (NIH / NIDCD 009269، 012831 والأذربيجانية الإدارية الملحق المنح NIH) إلى وى هونغ لين. نحن نخص بالشكر السيد تيم فورد في UMBC للحصول على المساعدة الفنية له في تصوير بالفيديو والتجهيز. ونود أيضا أن نشكر الدكتور دافني بلومبرغ، السيدة Chere تافه في UMBC والسيد نيكولاس ماكولوم من أوليمبوس أمريكا وشركة للحصول على مساعدة معداتهم في تصوير بالفيديو.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection | |||
Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
Operating scissors | WPI | 501753 | |
Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
[header] | |||
Tissue embedding | |||
Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
[header] | |||
Section staining | |||
Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved