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Method Article
* Estos autores han contribuido por igual
La nariz de mamífero es un órgano de múltiples funciones con estructuras internas complejas. La cavidad nasal está llena de diversos epitelios, como el epitelio olfativo, respiratorias, y de células escamosas, que difieren notablemente en localizaciones anatómicas, morfología y funciones. En ratones adultos, la nariz está cubierto con varios huesos del cráneo, lo que limita el acceso experimental a las estructuras internas, especialmente las de la posterior tal como epitelio olfativo principal (MOE). Aquí se describe un método eficaz para la obtención de los tejidos nasales casi enteras intactas y con organización anatómica conservado. El uso de herramientas quirúrgicas bajo un microscopio de disección, que secuencialmente quitamos los huesos del cráneo que rodean el tejido nasal. Este procedimiento se puede realizar en ambos, cabezas de piel de ratón paraformaldehído-fijos y recién disecados. El procedimiento de deshuesado completo dura aproximadamente 20-30 min, que es significativamente más corto que el tiempo experimental requerido para convencional de química basadacalcificación. Además, se presenta un método fácil para eliminar las burbujas de aire atrapadas entre los cornetes, lo cual es crítico para la obtención de secciones horizontales o coronal o sagital delgadas intactas de la preparación del tejido nasal. Tejido nasal preparado usando nuestro método se puede utilizar para la observación de todo el montaje de todo el epitelio, así como morfológica, inmunocitoquímica, ARN la hibridación in situ, y los estudios fisiológicos, especialmente en estudios en los que la región específica de examen y la comparación son de interés.
La cavidad nasal de mamíferos contiene varios tipos de tejidos y órganos que sirven para funciones distintas. La cavidad nasal constituye la parte de entrada de las vías respiratorias superiores, que permite el desplazamiento de aire dentro y fuera de los pulmones. El aire inhalado pasa a través de la cavidad nasal donde se somete a temperatura y humedad acondicionado 1, así como la limpieza o el filtrado para eliminar las sustancias irritantes y tóxicos y microorganismos infecciosos 2. Ambos tratamientos son realizados por epitelio nasal y los tejidos subepiteliales, incluyendo glándulas y vasos y son fundamentales para la protección de las vías respiratorias inferiores y los pulmones. Además de su papel en la respiración y la defensa epitelial, tejido de la nariz también contiene aparatos sensoriales periféricas de los sistemas olfativos y del trigémino, que detectan una amplia gama de sustancias químicas en el aire que pasa. Dependiendo de qué sistema se activa, la detección sensorial de productos químicos en la nariz puede obtener ya seaun sentido del olfato, irritación, o dolor 3,4.
El sistema olfativo periférico es complejo y compuesto de varios órganos sensoriales olfativas anatómicamente separados dentro de la cavidad nasal. Entre ellos, el epitelio olfativo principal (MOE) es la más grande, lo que constituye aproximadamente el 45-52% del epitelio nasal en roedores 5 y está ubicado en la región posterior. En la región anteroventral, hay un par de estructuras tubulares conocidos como el órgano vomeronasal 6, que se sientan a lo largo de cada lado del tabique nasal. Dos pequeñas agrupaciones adicionales de las neuronas sensoriales olfativas, conocidos como el órgano septal de Masera 7,8 y el ganglio Gruneberg 9, residen a lo largo del tabique ventral y dorsal de la región de entrada de la cavidad nasal, respectivamente. Estos órganos periféricos contienen neuro-epitelial con características distintivas en la morfología, la expresión de marcadores de células y la función fisiológica. Juntos detectar miles de oloresmoléculas con exquisita sensibilidad 10-12.
Además de los órganos sensoriales olfativas, la cavidad nasal también alberga otros sistemas sensoriales. Se sabe que las fibras del nervio trigémino peptidérgicas están presentes en el epitelio nasal, especialmente el epitelio respiratorio 13,14. Algunas de estas fibras detectar sustancias químicas irritantes y tóxicos, y son responsables de iniciar los reflejos protectores, tales como tos y los estornudos 4,15. Compuestos olorosos y amargo irritantes también pueden ser detectados por una población recientemente descubierta de células quimiosensoriales solitarios (SCC), muchos de los cuales están inervadas por fibras nerviosas del trigémino 16-19. Estos SCC se encuentran en mayor densidad en la zona de entrada de la cavidad nasal y de los conductos de entrada vomeronasal, dando a entender que ellos también pueden tener una función protectora 16-18. Por lo tanto, epitelio nasal puede diferir sustancialmente en función, la morfología y composición de las células en función de sulocalizaciones anatómicas.
Incluso dentro de una única y especializada epitelio, hay diferencias regionales. El Ministerio de Educación es un ejemplo de ello. Las líneas MOE varios cornetes, que son complicados y las estructuras curvadas. Debido a ellos, diferentes regiones de la experiencia de diferentes tasas de flujo de aire del Ministerio de Educación y, por tanto, diferente de difusión y tasas de eliminación de moléculas de olor en el aire 20. Además, se sabe que las neuronas sensoriales olfativas (OSN) que expresan un receptor de olor que se encuentran en una de las cuatro zonas de eludido el MOE 21,22. ¿Cómo afecta esta diferencia ubicación es en gran parte no se conoce la respuesta de una OSN a odorantes. Además, algunas poblaciones OSN exhiben preferencia regional. OSN guanililciclasa-D (GC-C) que expresan tienen distribuciones zonales a favor de las regiones cul-de-sac de las ectoturbinates 23,24. Más recientemente, encontramos una subpoblación de OSN canónicas que expresa transitoria receptor potencial canal M5 (trpM5) y se localiza preferentemente en las regiones laterales y ventral 25. Estos resultados indican que MOE no es uniforme. Sin embargo, ¿cómo estas diferencias regionales afectan codificación olfativas no se entiende. Esto es en parte porque la investigación fisiológica a fondo de la MOE y la nariz ha sido limitado por la dificultad de obtener intacta epitelio nasal con organización anatómica conservado con los métodos actuales.
El epitelio nasal son predominantemente rodeada por los huesos anteriores del cráneo, incluyendo el nasal, maxilar superior, palatino, cigomático, y los huesos etmoidales. En ratones adultos y otros modelos de roedores, estos huesos son duros y difíciles de eliminar sin dañar el tejido nasal estrechamente asociada, sobre todo los delicados cornetes. A menudo, la descalcificación de base química se utiliza para ablandar los huesos para permitir cryosectioning de los tejidos nasales para morfológica, inmunohistoquímica y estudios de hibridación in situ, sin embargo, depending de la edad del animal, el proceso de descalcificación puede durar durante la noche hasta 7 días 24,26-28. Este tratamiento también es limitada, ya que requiere el tejido sea fijador-preservada. Además, descalcificación química puede ser duro y afectar la inmunomarcación de algunos anticuerpos sensibles 29,30. Para los estudios fisiológicos, se requiere tejido vivo, y por lo tanto, estos experimentos se llevó a cabo a menudo en OSN aislados o rodajas MOE obtenidos a partir de los recién nacidos cuyos huesos del cráneo son delgados y blandos 17,31,32. Los estudios fisiológicos pueden también utilizar preparaciones todo el montaje por incisión de la cabeza 25,33,34, pero por lo general sólo la superficie medial de la nariz es de fácil acceso, lo que limita las grabaciones fisiológicas en otras áreas.
Aquí se describe un método eficaz deshuesado, manual para preparar los tejidos nasales intactos con preservada organización anatómica original y morfología. Nos quitamos secuencialmente los principales huesos de la anteriorSe necesita cráneo bajo un microscopio de disección para exponer un epitelio nasal casi en su totalidad intacta, manteniendo los huesos cornete delgadas intacta a menos que los ratones son muy antiguo y cryosectioning. También extendemos el método para preservar la conexión entre los tejidos nasales y los bulbos olfativos, así como el resto del cerebro, facilitando así el examen simultáneo de ambos circuitos periféricos y centrales. Nuestro método se puede utilizar para preparar paraformaldehído-fijo, así como fresco, tejido nasal vivo. Por lo tanto, se espera que nuestro método para facilitar los estudios morfológicos, inmunohistoquímicos y fisiológica de la respiración, el olfato, y nasales daños y enfermedades.
1. Ratón nariz Preparación
Se utilizó adultos C57BL / 6 ratones de fondo en este estudio. Todo el cuidado de los animales y los procedimientos son aprobados por el Cuidado de Animales y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Maryland, Condado de Baltimore.
1.1 La adquisición de la nariz de los ratones paraformaldahyde fijos
Figura 1. Los huesos de un cráneo de ratón A:. Vista dorsal del cráneo B:. Vista ventral del cráneo con la mandíbula eliminado. El cráneo fue preparado a partir de un ratón viejo de 40 días. Huesos individuales son de color para una mejor visualización. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
1.2 La adquisición de la nariz de los ratones recién sacrificados
2. Incisivo, anterior Vomer y hueso maxilar Removal
3. Hueso Nasal y Dorsal Extracción de la placa cigomática
4. Lateral Extracción de la placa cigomática
5. Orbit Bone Removal
6. Remoción del hueso etmoidal
7. Preparación nariz por cryosectioning
El uso de este método, podemos obtener de manera fiable los tejidos nasales casi totalmente intacta. Figura 2A muestra una imagen de la muestra nasal adulto de una cabeza de paraformaldehído-fijo. En esta muestra, los cuatro órganos sensoriales sub-olfativas, como el Ministerio de Educación, órgano septal, el ganglio Gruneberg y VNO, están intactos. Además, el epitelio respiratorio y tejidos subepiteliales, como las glándulas y vasos, se conservan. Hemos utilizado con éxito este método en un n...
Aquí, hemos demostrado un procedimiento paso a paso para aislar el tejido olfativo y respiratoria intacta de la nariz del ratón mediante la eliminación secuencial de los huesos que rodean sin dañar el tejido de abajo. Se demuestra que la eliminación de hueso cuidadosa puede conservar incluso los tejidos más delicados en su totalidad. También compartimos la visión de las posibles modificaciones de esta técnica, en la que nos aislamos el cerebro y los tejidos nasales juntos para preservar la conexión nerviosa. E...
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Este trabajo fue apoyado por becas de investigación (NIH / NIDCD 009269, 012831 y ARRA administrativos suplemento subvenciones NIH) a Lin Weihong. Agradecemos especialmente al Sr. Tim Ford en UMBC por su asistencia técnica en la grabación en vídeo y procesamiento. También queremos dar las gracias al Dr. Blumberg Daphne, la Sra. Chere Petty en UMBC y el Sr. Nicholas McCollum de Olympus America Inc. por su asistencia equipos de videograbación.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection | |||
Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
Operating scissors | WPI | 501753 | |
Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
[header] | |||
Tissue embedding | |||
Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
[header] | |||
Section staining | |||
Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
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