القبض في وقت واحد في الوقت الحقيقي الصور في قناتين الانبعاثات باستخدام نظام تقسيم كاميرا مزدوجة الانبعاثات: تطبيقات لخلية التصاق

Summary

نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة للاللونين مضان المجهري توليد تسلسلات الصور في الوقت الحقيقي مع دقة بصرية والزماني استثنائية، وهو شرط لبعض المقايسات الخلية الحية بما في ذلك بالتوازي المقايسات غرفة تدفق وحة التصاق. عندما يعمل البرنامج لدمج الصور من القنوات الانبعاثات المكتسبة في وقت واحد، ويتم إنتاج تسلسلات الصور pseudocolored.

Abstract

متعددة الألوان المناعي المجهري للكشف عن جزيئات معينة في غشاء الخلية يمكن أن يقترن مع المقايسات غرفة تدفق موازية لوحة للتحقيق في الآليات التي تحكم التصاق الخلية في ظل ظروف تدفق الحيوية. على سبيل المثال، وسرطان الخلايا المسمى مع fluorophores متعددة يمكن perfused على ركيزة يحتمل رد الفعل لنمذجة آليات الانبثاث السرطان. ومع ذلك، متعدد القنوات أنظمة كاميرا واحدة ولون الكاميرات أوجه القصور المعرض في الحصول على الصور في الوقت الحقيقي للتحليل الخلية الحية. للتغلب على هذه القيود، استخدمنا كاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوجة في وقت واحد لالتقاط تسلسل الصور في الوقت الحقيقي من الخلايا fluorescently المسمى في غرفة التدفق. ويتراوح الطول الموجي مرشح أنظمة تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة محددة في اثنين من الكاميرات أحادية اللون اتفاقية مكافحة التصحر، وبالتالي التقاط صور متطابقة في وقت واحد اثنين مكانيا ولكن fluorophore محددة. بعد ذلك، يتم الجمع بين psuedocolored الصور قناة واحدة الى واحدفي الوقت الحقيقي اندمجت تسلسل التي يمكن أن تكشف عن العديد من الجزيئات المستهدفة على خلايا تتحرك بسرعة عبر منطقة الفائدة.

Introduction

طرق لتحليل جزيئات على سطح الخلية، مثل المناعية، وتوظيف تحقيقات التي مترافق كيميائيا لfluorophores، مما يسمح للكشف عن الجزيئات المستهدفة. وعادة ما يتم تسجيل التصوير الخلية الحية والهيدروديناميكية فحوصات التصاق الخلية المستندة إلى تدفق مع الكاميرات أحادية اللون CCD صمم للقبض على العمليات الفسيولوجية على المستوى الخلوي و / أو الجزيئية ^{1، 2.} هذه الكاميرات هي حساسة للغاية، وتقديم معدلات الإطار بسرعة (أكبر من 30 لقطة في الثانية الواحدة)، وتقديم القرار الزماني استثنائية (بسبب معدلات الإطار بسرعة ومرات التعرض القصير). ومع ذلك، يمكن للكاميرات التقاط أحادية اللون فقط قناة واحدة الانبعاثات (الكشف عن fluorophore واحد) لجمع الصور. ويمكن إدراج نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا واحدة لالتقاط القنوات الانبعاثات متعددة ولكن غالبا ما يقلل من مجال الرؤية وتتطلب الوقت نفسه التعرض لتصوير جميع القنوات. لالتقاط ألوان الطيف الكامل من الخلايا المسمى مع multipلو fluorophores، وكاميرا اللون يمكن استخدامها كبديل. ومع ذلك، والكاميرات اللون ليست قادرة عموما على تقديم القرار الزماني المطلوب لتصوير الخلايا الحية في بعض التطبيقات. هناك حاجة إلى جهاز التصوير أخرى للتطبيقات الذي هو مفيد لصورة الخلايا الحية في موجات متعددة مع الحفاظ على القرار الزماني عالية. تطبيق تجريبي رئيس هو مواز لوحة غرفة تدفق التصاق الفحص، التي و perfused الخلايا في الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية على ركيزة يحتمل رد الفعل ^{1، 3.} الخلايا في تدفق التي تعبر عن جزيئات محددة سطح الخلية قد تلتزم ولفة على الركيزة، مثل أحادي الطبقة الخلية التعبير عن جزيئات الالتصاق أو البروتينات المصفوفة خارج الخلية، كثف السطح ^{4، 5.} الخلايا المتداول قد تخضع حركة دورانية ومتعدية في أجزاء من الثانية. الميزات الجزيئية على المتداول والخلايا الملتصقة، مثل مجموعات من جزيئات سطح الخلية، وأيضا potentiالقاعدة لإعادة تنظيم الخضوع نشطة على سطح الخلية. وبالتالي، يجب نظم التصوير يوفر القرار الزماني استثنائية (30 لقطة في الثانية أو أكثر و"قريبة من الصفر" مرات التعرض) لإنشاء تسلسل الصور التي توضح تطور خطوة بخطوة من الخلايا المتداول ^{6، 7.} نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة قادرون على تلبية هذه المطالب لتصوير الخلايا المسمى مع fluorophores متعددة.

تقسيم نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة وقنوات مرشح مضان في اثنين من الكاميرات مماثلة لالتقاط الصور في وقت واحد اثنين متطابقة مكانيا ولكن fluorophore محددة مع الإبقاء على حقل كامل من الرأي. هذه التكنولوجيا تمكن المقارنة المباشرة من الصورة التي تم التقاطها في الوقت الحقيقي في كل قناة، وتتيح للمستخدم التبديل بسرعة بين نماذج الكاميرا مع قدرات التصوير المختلفة. هذه الميزة مفيدة لإجراء تعديلات على إعدادات التقاط الصور في كاميرا واحدة التي تسمح أفضل نظام لالتقاطfluorophores مع كثافات مختلفة، عمر، ومعاملات الانقراض ^8. إلى جانب برامج التصوير، ونظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة تسمح للتسجيل في الوقت الحقيقي من فحوصات التصوير الخلية الحية في موجات متعددة، ويمكن أن تعزز في المختبر المقايسات التي تستخدم مضان لدراسة سلوك الخلية.

Protocol

1. تركيب البرمجيات

1. شراء StreamPix 5 متعدد كاميرا البرنامج مع وحدة SimulPix أو برامج التصوير الأخرى قادرة على جمع والجمع بين الصور الملتقطة بواسطة الكاميرات أحادية اللون اتفاقية مكافحة التصحر.
2. الحد الأدنى لمتطلبات StreamPix 5 ما يلي: A PC مجهزة كور 2 ديو 2.4 غيغاهرتز مع أو أفضل مع 2 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي أو أعلى. كاميرا الرقمية أو التناظرية IEEE بدعم ومتوافقة الإطار المختطف. نوافذ XP/7/Vista 32 أو 64 بت. ورصد دعم القرار 1،024 × 768 أو أعلى. (ينصح OCU التعبير عن 16X أو أفضل) ألف محول الرسومات مع أداء 2D جيدة ومحرك القرص الثابت 7،200 لفة في الدقيقة لتسجيل مع RAID-O التكوين.

2. تركيب نظام كاميرا مزدوجة قادرة على اثنين من لون في وقت واحد التصوير في الوقت الحقيقي

1. ربط الخائن DC2 Photometrics الانبعاثات، أو ما شابه ذلك الجهاز كاميرا مزدوجة تقسيم الانبعاثات، إلى المجهر عن طريق تحريك محول DC2 C-جبل بمنفذ الفيديو من ميكرoscope ان هذه المساكن من مزدوج اللون على الجهاز يمكن الوصول إليها.
2. إدراج اثنين من الكاميرات أحادية اللون اتفاقية مكافحة التصحر في الإناث C-جبل 1 والإناث C-جبل 2. كاميرات متطابقة هي الأفضل. يمكن استخدام كاميرات مماثلة، ولكن التوافق تعتمد على الأجهزة الداخلية، والأهم من مستشعر الصورة CCD.
3. استخدام برامج التصوير لعرض الصور من كل من الكاميرات. تطبيق - (2.3.4 2.3.1) لStreamPix 5 مع وحدة SimulPix ويجب أن تتكيف لغيرها من برامج التصوير كاميرا متعددة الخطوات التالية.
   1. مفتوحة StreamPix 5 وحدد "مساحة العمل" في الشريط المهمة.
   2. مفتوحة "مدير مساحة العمل" التي تقع في أقصى اليمين من الشاشة وحدد "مساحة عمل جديدة".
   3. بعد تسمية كاميرا، اتبع البرنامج يطالبك لاختيار المختطف من قائمة ما قبل بالسكان. حدد المختطف مطابقة طراز الكاميرا وتكرار لمساحة الكاميرا الثانية. لمساحة المدمجة، كرر مرة أخرى ولكن "جميع الكاميرات قيد الاستخدام" خطأ مessage سوف تظهر. هذه الرسالة أمر طبيعي.
   4. مرة واحدة يتم تحميل مساحة العمل المدمجة، تعيين الكاميرات من مساحة العمل 1 و 2 مساحة العمل إلى مساحة العمل المدمجة في لوحة لرسو السفن تقع على الجانب الأيمن من الشاشة المشاهدة.
4. محاذاة الكاميرات في الكاميرا نظام تقسيم الانبعاثات المزدوجة.
   1. محاذاة الكاميرات في حقل مشرق أو الطوري مع شبكة المعايرة المقدمة من قبل الشركة المصنعة باستخدام الهدف 40X PlanApo (أو أكبر).
   2. إرسال الضوء على العدسات المجهر، ووضع معايرة الشبكة المعدنية المغلفة التي تم توفيرها من قبل الشركة المصنعة على المسرح المجهر، وساحة الشبكة على المسرح المجهر.
   3. جلب الشبكة إلى التركيز.
   4. تهجير، ولكن لا تقم بإزالة والإسكان مزدوج اللون لمحاذاة الكاميرا 1 (الكاميرا الالتفافية). عرض الشبكة دون binning ودون autoscaling. تركيز الصورة باستخدام قرص ضبط التركيز على ميناء جبل C-1.
   5. دفع السكن مزدوج اللون في CHANNE المزدوجل الجهاز الاستحواذ بالكامل، بحيث يتم تقسيم الصورة من قبل مزدوج اللون إلى كل من الكاميرات.
   6. ترخي الثلاثة 5/64 "مجموعة مسامير وتدوير الكاميرا الثانية على الأنثى C-جبل 2 حتى توجه الشبكة هو متطابقة في كل من الصور. عن طريق الاتصال الهاتفي التكيف التركيز على C-جبل الميناء 2، وجلب الصورة من الكاميرا 2 في التركيز.
   7. وضع اللمسات الأخيرة على تشكيلة باستخدام الصورة جنبا إلى جنب في مساحة العمل المدمجة من برامج التصوير. هذا يسمح لأحد أن يرى في الوقت الحقيقي pseudocolor تراكب الصورتين من الشبكة المعايرة. توفيق أوضاع صورة مجتمعة فقط باستخدام R / L مقبض الباب على الجانب الأيمن من DC2. ضبط هذا المقبض حتى يتم محاذاة الحدود العمودية يمين / يسار الصور بدقة.
   8. استخدام مقبض U / D لضبط المحاذاة لأعلى / أسفل الصورة الثانية حتى يتم محاذاة قضبان أفقية الشبكة بشكل صحيح.
   9. إذا خلال محاذاة لأعلى / أسفل كاميرا دوران طفيف يحدث، صحيح هذه القضية من خلال تخفيف 5/64 "بوصة شاش ثلاثةWS للكاميرا 2 وتدوير حتى يتم محاذاة الصورة المعروضة بشكل صحيح.

3. إعداد خلايا سرطان لوحة الموازي تدفق غرفة التصاق الفحص

1. ثقافة BT-20 خلايا سرطان الثدي في الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) تستكمل لإكمال المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين الستربتوميسين عند 37 درجة مئوية و 5.0٪ CO ₂ كما سبق وصفه ^2.
2. الخلايا السرطانية الحصاد مع العلاج المخفف التربسين وعدد الخلايا مع عدادة الكريات.
3. غسل وتعليق الخلايا في 10 ⁷ خلية / مل في 0.1٪ الزلال من المصل البقري (BSA) في DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS +).
4. تمييع الأجسام المضادة الأولية، والماوس المنقى CD24 مكافحة الفئران والإنسان النقي HECA-452 (المستضدات مكافحة sialofucosylated)، إلى تركيز الأمثل محددة سلفا في 0.1٪ BSA DPBS +. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة ^{9، 10.}
5. خلايا الطرد المركزي في 1،200 دورة في الدقيقة للحصول على بيليه الخلية. ASPIمعدل الأجسام المضادة الأولية، وغسل الخلايا مرتين مع 0.1٪ BSA DBPS +.
6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية، الماعز المضادة للماوس مفتش AlexaFluor 568 (الانبعاثات كحد أقصى، 603 نانومتر)، والماعز لمكافحة الفئران الغلوبولين المناعي AlexaFluor 488 (الانبعاثات كحد أقصى، 519 نانومتر)، إلى تركيز الأمثل محددة سلفا في 0.1٪ BSA DPBS +. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة.
7. غسل الخلايا مرتين ووقف في 0.1٪ BSA DPBS + في 10 ⁶ خلية / مل في 0.1٪ BSA DPBS +.

4. إعداد رد الفعل الركيزة لوحة الموازي تدفق غرفة التصاق الفحص

1. ربط اثنين من أنابيب منفصلة أطوال إلى مدخل ومخرج موانئ غرفة تدفق موازية لوحة التي تناسبها داخل 35 مم الأنسجة طبق الثقافة. واحد أنبوب الاتصال الخزان من الخلايا المسمى علقت في 0.1٪ BSA DPBS + والآخر إلى ضخ حقنة، والتي سوف تسحب السوائل بمعدل تدفق محدد.
2. توصيل خط فراغ إلى غرفة التدفق ^1.
3. وضع غرفة تدفق أكثر من 35 ملم زراعة الأنسجة ديركلات الترجيح التي تحتوي على أحادي الطبقة من الخلايا المبيض الهامستر الصيني معربا عن E-selectin (CHO-E). وقد نمت الخلايا CHO-E في MEM المتوسطة كاملة عند 37 درجة مئوية و 5.0٪ CO _{² 2.}
4. ضبط غرفة التدفق و / أو تدفق غرفة طوقا لضمان وجود ختم فراغ كاف ^1.
5. سحب السائل من الخزان، ورصد التجمع غرفة تدفق لختم الصحيح وأي دليل مرئي لتشكيل فقاعة الهواء ^1.
6. وضع تدفق التجمع الغرفة على المجهر (لايكا 6000B DMI) ^1.

5. اللونين الحصول على صورة

1. السلطة مصدر الضوء المدمجة لايكا EL-6000، أو جهاز مماثل، لتوليد ضوء ارتفاع كثافة وزوجين قبل أن تتحول إلى دليل ضوء. استخدام مجهر مقلوب لتمرير هذا الضوء من خلال مرشح مزيج مكعب، أي G / R (أخضر / أحمر) مرشح مكعب، لإثارة fluorophores من المطلوب اللون / الشدة.
2. ضمان السكن مزدوج اللون هو في وضع التشغيل الصحيح (الاكتئاب) وليس في وضع الالتفافية.
3. تعمل المجهر مضان في وضع وتحديد السليم مكعب مرشح مضان (أخضر / أحمر).
4. تحديد وقت التعرض وزيادة في كاميرا 1 (الحمراء؛ 620 ± 60 نانومتر) وكاميرا 2 (الأخضر؛ 535 ± 40 نانومتر).
   1. كساد مزدوج اللون للحصول على صور في القنوات الانبعاثات الحمراء والخضراء على حد سواء. استخدام مقايسة غرفة التدفق مع الخلايا المسمى مع fluorophore الحمراء فقط، والحصول على صورة في القناة الحمراء عن طريق ضبط وقت التعرض للكاميرا 1 في "إعدادات الحية" من برامج التصوير.
   2. تطابق وقت التعرض للكاميرا 2 إلى وقت التعرض للكاميرا 1. إذا لوحظ حدوث الصورة في قناة خضراء، والتحف تنزف من خلال وجود وزمن التعرض في كل من الكاميرات يحتاج إلى خفضها.
   3. الحفاظ على وقت التعرض ما يعادلها في الكاميرا وكاميرا 2 1، والحد من فترة التعرض حتى قطعة أثرية، من خلال تنزف لم تعد مرئية في قناة خضراء. ضبط كسب كاميرا 1 لتحسين صورة visibilitذ في القناة الحمراء إذا لزم الأمر.
   4. كرر الخطوات من 5.4.1 - 5.4.3 مع الخلايا المسمى مع fluorophore الخضراء فقط، ولكن تحديد زمن التعرض مع كاميرا 2 إلى خلايا الصورة في قناة خضراء دون التحف تنزف من خلال في القناة الحمراء التي جمعتها كاميرا 1.
   5. الأجسام المضادة Retitrate إذا التحف تنزف من خلال لا يمكن القضاء عليها ^11، أو إذا مرات التعرض للكاميرا 1 كاميرا 2 وتختلف اختلافا كبيرا بحيث اندمجت قد تكون الصور المنحرفة زمنيا.
5. استخدام برامج التصوير لعرض الصور التي تم التقاطها في وقت واحد من اثنين من الكاميرات أحادية اللون اتفاقية مكافحة التصحر في التجربة غرفة التدفق.
6. دمج الصور التي تم جمعها من كل من الكاميرات باستخدام وحدة SimulPix من Streampix 5 أو حزمة برامج بديلة.
7. استخدام التعديلات التصحيح الرقمي في SimulPix أو برامج بديلة لمحاذاة مكانيا الصور المدمجة، إذا لزم الأمر. يمكن تصحيح الصور مع وحدة لSimulPix الأفقي والرأسي، والتسويات التناوب.

النتائج

تم استخدام غرفة تدفق موازية لوحة التصاق مقايسة ليبرهن على وجود نظام مزدوج تقسيم الانبعاثات الكاميرا التي استولت في وقت واحد تسلسلات الصور في الوقت الحقيقي في قنوات الانبعاثات اثنين (الشكل 1). الكشف عن الكاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوج BT-20 الخلايا التي تم ...

Discussion

الكاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوج لديه القرار المكانية والزمانية، والبصرية اللازمة لالتقاط صور ذات جودة عالية في التطبيقات حيث الخلية أو الحركة الجزيئية سريع. في توليد نتائج ممثل، تم الأمثل المعلمات في النظام المزدوج تقسيم الانبعاثات الكاميرا، بما في ذلك إعداد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
BT-20 cells	ATCC	HTB-19
CHO-E cells	Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 monoclonal antibody	BD Biosciences	555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody	BD Biosciences	555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
			[header]
			Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera	Q Imaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera	Q Imaging	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter	Photometrics	DC2
Inverted Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix