Capture simultanément en temps réel des images en deux canaux d'émission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: Applications à l'adhésion cellulaire

Résumé

Émissions des systèmes de séparation à double caméra pour deux couleurs microscopie à fluorescence générer en temps réel des séquences d'images avec une résolution optique et temporelle exceptionnelle, une exigence de certains tests cellulaires en direct, y compris des essais parallèles chambre d'écoulement de la plaque d'adhérence. Lorsque le logiciel est utilisé pour fusionner des images de canaux d'émission acquis simultanément, des séquences d'images pseudocolored sont produites.

Résumé

Multi-color microscopie par immunofluorescence pour détecter des molécules spécifiques dans la membrane cellulaire peut être couplé avec des dosages en parallèle de la chambre d'écoulement de la plaque pour étudier les mécanismes qui régissent l'adhérence cellulaire dans des conditions d'écoulement dynamique. Par exemple, les cellules cancéreuses marquées avec des fluorophores multiples peuvent être perfusées sur un substrat potentiellement réactifs pour modéliser les mécanismes de la métastase cancéreuse. Cependant, multi-canaux systèmes de caméras et appareils photo unique de couleur présentent des lacunes dans l'acquisition d'image pour analyse en temps réel des cellules vivantes. Pour surmonter ces limitations, nous avons utilisé un système de séparation des émissions de double caméra pour capturer simultanément en temps réel des séquences d'images de cellules marquées par fluorescence dans la chambre d'écoulement. Longueur d'onde filtre des systèmes de séparation d'émission de l'appareil photo à double sens varie en deux caméras CCD monochrome, capturant ainsi simultanément deux images identiques mais spatialement spécifique fluorophores. Par la suite, psuedocolored images d'un canal sont combinés en un seulen temps réel a fusionné la séquence qui peut révéler de multiples molécules cibles sur des cellules se déplaçant rapidement à travers une région d'intérêt.

Introduction

Des procédés pour l'analyse de molécules sur la surface des cellules, telles que l'immunocoloration, emploient des sondes qui sont chimiquement conjugués à des fluorophores, ce qui permet la détection de molécules cibles. Imagerie des cellules vivantes et hydrodynamiques des essais d'adhérence des cellules basées sur les flux sont généralement enregistrés avec des caméras CCD monochrome conçus pour capturer les processus physiologiques au niveau cellulaire et / ou moléculaire ^{1, 2.} Ces caméras sont très sensibles, offrir des taux de trame rapides (plus de 30 images par seconde), et de fournir une résolution temporelle exceptionnelle (en raison de taux de trame rapides et des temps d'exposition court). Toutefois, les caméras monochromes ne peuvent capturer un canal d'émission unique (détection d'un seul fluorophore) pour recueillir des images. Simples systèmes caméra émission de séparation peuvent être incorporés à capturer plusieurs canaux d'émission mais réduisent souvent le champ de vision et nécessitent le même temps d'exposition pour l'imagerie de tous les canaux. Pour capturer le spectre complet des couleurs de cellules marquées par multiparele fluorophores, une caméra couleur peut être utilisé comme une alternative. Cependant, les caméras couleurs ne sont généralement pas capables de fournir la résolution temporelle souhaitée pour l'imagerie des cellules vivantes dans certaines applications. Un autre dispositif de formation d'image est nécessaire pour les applications dans lesquelles il est avantageux de l'image des cellules vivantes dans des longueurs d'ondes multiples tout en conservant une haute résolution temporelle. Une application expérimentale de choix est l'analyse de l'adhérence de la chambre d'écoulement à plaques parallèles, dans lequel les cellules sont perfusées dans des conditions physiologiquement pertinentes sur un substrat potentiellement réactif ^{1, 3.} Les cellules dans le flux qui expriment des molécules de surface spécifiques de cellules peuvent adhérer et roulent sur ​​le substrat, par exemple une monocouche de cellules exprimant des molécules d'adhésion ou des protéines de surface adsorbé extracellulaires matricielles ^{4, 5.} Cellules de roulement peuvent subir un mouvement de rotation et de translation en une fraction de seconde. Les caractéristiques moléculaires et de laminage sur les cellules adhérentes, telles que des grappes de molécules de surface cellulaire, ont également le potentiomètreal à subir une réorganisation active sur la surface de la cellule. Ainsi, les systèmes d'imagerie doivent fournir une résolution temporelle exceptionnel (30 images par seconde ou plus, et "proche de zéro" temps d'exposition) pour générer une séquence d'images qui illustre la progression étape par étape de la cellule de roulement ^{6, 7.} Systèmes de séparation double caméra d'émission sont capables de répondre à ces exigences pour l'imagerie de cellules marquées avec des fluorophores multiples.

Systèmes de séparation double caméra d'émission répartis et canaux de fluorescence de filtre en deux caméras semblables à capturer simultanément deux images identiques mais spatialement spécifique fluorophores tout en conservant la totalité du champ de vue. Cette technologie permet la comparaison directe de l'image capturée en temps réel dans chaque canal et permet à l'utilisateur de basculer rapidement entre les modèles d'appareil photo avec différentes capacités d'imagerie. Cette fonction est utile pour faire des ajustements aux paramètres de capture d'image dans un appareil photo qui mieux permettre au système de capturefluorophores avec différentes intensités, durées de vie, et des coefficients d'extinction ^8. Couplée avec un logiciel d'imagerie, des systèmes de séparation d'émission de caméra double permet l'enregistrement en temps réel en direct des dosages d'imagerie des cellules dans les longueurs d'onde multiples et peuvent améliorer les essais in vitro qui utilisent la fluorescence pour étudier le comportement des cellules.

Protocole

Une. Installation du logiciel

1. Achetez Streampix 5 logiciels multi-caméras avec module SimulPix ou un autre logiciel d'imagerie capable de collecter et combiner des images captées par les caméras CCD monochrome.
2. Exigences minimales pour Streampix 5 comprennent: Un PC équipé Core 2 Duo 2,4 GHz ou mieux avec 2 Go de RAM ou plus. Une caméra IEEE soutenu numérique ou analogique et d'acquisition d'images compatible. Fenêtres XP/7/Vista 32 ou 64 bits. Un moniteur supportant une résolution de 1024 x 768 ou supérieure. Une carte graphique avec de bonnes performances 2D (UCO express 16x ou plus est recommandé) et 7200 RPM disque dur pour l'enregistrement avec configuration RAID-O.

2. Installation d'un système de double caméra Capable de deux couleurs simultanée d'imagerie en temps réel

1. Connectez le séparateur DC2 Photometrics d'émission, ou dispositif d'émission de fractionnement double caméra similaire, au microscope en faisant glisser l'adaptateur DC2 monture C dans le port vidéo de la MICRoscope de telle sorte que le logement de la dichroïque sur le dispositif est accessible.
2. Insérez deux caméras CCD monochrome en femelle monture C 1 et C-femme monter 2. Caméras identiques sont préférables. Caméras similaires peuvent être utilisés, mais dépend de la compatibilité matérielle interne, le plus important au capteur d'image CCD.
3. Utilisez le logiciel d'imagerie pour afficher les images des deux caméras. Les étapes suivantes (2.3.1 - 2.3.4) s'appliquent à Streampix 5 avec module SimulPix et doivent être adaptés à d'autres logiciels d'imagerie multi-caméra.
   1. Ouvrir Streampix 5 et sélectionnez "espace de travail" dans le ruban de la tâche.
   2. Ouvrir "gestionnaire d'espace de travail», situé à l'extrême droite de l'écran et sélectionnez «nouvel espace de travail".
   3. Après la nomination d'un appareil photo, suivez le logiciel demande de sélectionner une carte d'acquisition d'une liste pré-remplie. Sélectionnez la carte d'acquisition correspondant au modèle de l'appareil et répétez l'opération pour le deuxième espace de travail de la caméra. Pour l'espace de travail fusionnée, répéter une fois de plus, mais «toutes les caméras sont en cours d'utilisation" erreur message s'affiche. Ce message est normal.
   4. Une fois l'espace de travail fusionnée est chargé, affecter les caméras de l'espace de travail et espace de travail 1 2 à l'espace de travail fusionnée dans le panneau d'accueil situé sur le côté droit de l'écran de visualisation.
4. Alignez les caméras dans le système de séparation des émissions de double caméra.
   1. Alignez les caméras dans le champ lumineux ou contraste de phase avec la grille de calibrage fourni par le fabricant en utilisant un objectif Planapo 40X (ou plus).
   2. Envoyer lumière pour les oculaires du microscope, placer la grille de calibrage revêtus de métal qui a été fourni par le fabricant sur la platine du microscope et de la place de la grille sur la platine du microscope.
   3. Apportez la grille dans le foyer.
   4. Déplacer, mais ne pas retirer le boîtier dichroïque pour aligner la caméra 1 (caméra de dérivation). Afficher la grille sans binning et sans le redimensionnement. Concentrer l'image en utilisant la molette de réglage de mise au point sur le port monture C 1.
   5. Poussez le boîtier dichroïque dans le double Channel dispositif d'acquisition entièrement, de sorte que l'image est divisée par le dichroïque à deux caméras.
   6. Desserrer les trois 5/64 "set vis et tourner la deuxième caméra sur la femelle monture C 2 jusqu'à ce que l'orientation de la grille est identique dans les deux images. Utilisation de la molette de réglage de mise au point sur le C-monter le port 2, amener l'image de la caméra 2 dans le foyer.
   7. Achever l'alignement de l'aide de l'image combinée dans l'espace de travail fusionnée du logiciel d'imagerie. Cela permet de voir un pseudo-superposition en temps réel des deux images de la grille d'étalonnage. Ajuster les positions d'image combinées en utilisant uniquement le système R / L bouton sur le côté droit de la DC2. Réglez ce bouton jusqu'à ce que droite / gauche limite verticale des images est précisément aligné.
   8. Utilisez le bouton U / D pour régler l'alignement haut / bas de la deuxième image jusqu'à ce que les barres horizontales de la grille sont correctement alignés.
   9. Si lors de l'alignement vers le haut / vers le bas une légère rotation de la caméra se produit, Corriger cette question en desserrant les trois 5/64 "scre poucesws pour appareil photo 2 et tourner jusqu'à ce que l'image affichée est correctement aligné.

3. Préparation des cellules cancéreuses pour plaques parallèles Chambre de circulation Essai d'adhésion

1. Culture BT-20 des cellules de cancer du sein dans un milieu essentiel minimum (MEM) additionné de milieu complet avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine à 37 ° C et 5,0% de CO _2, comme précédemment décrit ^2.
2. Récolte des cellules cancéreuses avec un traitement à la trypsine diluée et compter les cellules avec un hémocytomètre.
3. Laver et suspendre les cellules à 10 ⁷ cellules / ml dans 0,1% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du DPBS avec calcium et magnésium (DPBS +).
4. Diluer les anticorps primaires, les souris purifié anti-CD24 humain et de rat purifiée HECA-452 (les antigènes anti-sialofucosylated), à une concentration optimale prédéterminée dans 0,1% de BSA DPBS +. Incuber les cellules pendant 30 min ^{9, 10.}
5. Centrifuger les cellules à 1200 rpm pour obtenir un culot cellulaire. Aspiévaluer anticorps primaire, et laver les cellules deux fois avec 0,1% de BSA SPD +.
6. Diluer anticorps secondaires, de chèvre anti-IgG de souris AlexaFluor 568 (émission max, 603 nm), et de chèvre anti-IgM de rat AlexaFluor 488 (émission max, 519 nm), à une concentration optimale prédéterminée dans 0,1% de BSA DPBS +. Incuber les cellules pendant 30 min.
7. Laver les cellules deux fois et suspendre dans 0,1% de BSA DPBS + à 10 ⁶ cellules / ml dans 0,1% de BSA DPBS +.

4. Préparation du réactif Substrat pour plaque parallèle Chambre de circulation Essai d'adhésion

1. Relier deux longueurs de tube séparées pour les ports de la chambre d'écoulement parallèle de la plaque qui s'adapte à l'intérieur d'une boîte de culture tissulaire de 35 mm entrée et de sortie. Un tube se connecte au réservoir de cellules marquées en suspension dans 0,1% de BSA DPBS + et l'autre à la pompe à seringue, qui va retirer du fluide à un débit spécifié.
2. Connexion à une ligne vide à la chambre d'écoulement ^1.
3. Placez la chambre d'écoulement sur le 35 mm culture de tissus dish contenant une monocouche de cellules d'ovaire de hamster chinois exprimant la sélectine E (CHO-E). Des cellules CHO-E ont été cultivées dans du milieu MEM complet à 37 ° C et 5,0% de CO ₂ ^2.
4. Ajuster la chambre d'écoulement et / ou le joint de la chambre d'écoulement afin d'assurer un joint étanche au vide suffisant ^1.
5. Retirer du fluide depuis le réservoir, le contrôle de l'assemblage de la chambre d'écoulement pour une bonne étanchéité, et aucune preuve visuelle de la formation de bulles d'air ^1.
6. Placer l'assemblage de la chambre d'écoulement sur ​​le microscope (Leica DMI 6000B) ^1.

5. Deux couleurs d'acquisition de l'image

1. Puissance d'une source Leica EL-6000 lumière compact, ou un dispositif similaire, pour générer une lumière de forte intensité et deux dans un guide de lumière. Utilisez un microscope inversé à passer cette lumière à travers un filtre de combinaison cube, soit G / R (vert / rouge) filtre cube, pour exciter des fluorophores de couleur / intensité souhaitée.
2. Assurez logements dichroïque est en position de fonctionnement correct (déprimé) etn'est pas en mode de dérivation.
3. Fonctionner en mode microscope de fluorescence et sélectionnez bon cube de filtre de fluorescence (vert / rouge).
4. Déterminer le temps d'exposition et le gain en appareil photo 1 (rouge, 620 ± 60 nm) et un appareil photo 2 (vert, 535 ± 40 nm).
   1. Appuyez sur la dichroïque pour obtenir des images dans les deux canaux d'émission rouge et vert. Utilisation d'un dosage de la chambre d'écoulement avec des cellules marquées avec le fluorochrome rouge seulement, et obtenir une image dans le canal rouge en ajustant le temps d'exposition de la caméra 1 en "direct" paramètres du logiciel d'imagerie.
   2. Correspondre à la durée d'exposition de l'appareil photo 2 à la durée d'exposition de la caméra 1. Si une image est observée dans le canal vert, les artefacts de purge-through sont présents et la durée d'exposition dans les deux appareils doit être réduite.
   3. Garder le temps d'exposition équivalent à huis clos et une caméra 2, de réduire le temps d'exposition jusqu'à ce que l'artefact de purge par n'est plus visible dans le canal vert. Réglez le gain de la caméra 1 pour améliorer l'image visibility dans le canal rouge, si nécessaire.
   4. Répétez les étapes 5.4.1 - 5.4.3 avec des cellules marquées avec le fluorophore vert seulement, mais de définir le temps d'exposition avec un appareil photo 2 cellules d'image dans le canal vert sans artefacts purge travers du canal rouge recueillies par la caméra 1.
   5. Anticorps Retitrate si artefacts purge par ne peuvent être éliminés ^11, ou si le temps d'exposition de la caméra 1 et la caméra 2 sont sensiblement différents, tels que la fusion des images peuvent être temporellement alignées.
5. Utilisez le logiciel d'imagerie pour visualiser les images capturées simultanément à partir de deux caméras CCD monochrome dans l'expérience de la chambre d'écoulement.
6. Fusionner des images recueillies par les deux caméras en utilisant le module de SimulPix Streampix 5 ou un logiciel alternatif.
7. Utiliser les ajustements de correction numériques en SimulPix ou logiciel alternatif pour aligner spatialement les images fusionnées, le cas échéant. Les images peuvent être corrigées avec le module SimulPix pour horizontal, verticalet les ajustements de rotation.

Résultats

Un essai d'adhérence à la chambre d'écoulement à plaques parallèles a été utilisé pour démontrer un système de fractionnement appareil d'émission double qui a capturé simultanément en temps réel de séquences d'images en deux voies d'émission (figure 1). Le système de division de l'émission de la caméra double détecté BT-20 cellules qui ont été marquées par fluorescence avec CD24 anti-humain et HECA-452 (détection des antigènes sialofucosylated) des antic...

Discussion

Le système de fractionnement des émissions de double caméra a une résolution spatiale, temporelle, et optique nécessaire pour capturer des images de haute qualité dans des applications où la cellule ou le mouvement moléculaire est rapide. Dans la génération des résultats représentatifs, les paramètres du système de fractionnement caméra émission double, y compris les paramètres logiciels et réglages de l'appareil, ont été optimisés pour obtenir une séquence d'image fusionnée dans laquelle ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
BT-20 cells	ATCC	HTB-19
CHO-E cells	Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 monoclonal antibody	BD Biosciences	555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody	BD Biosciences	555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
			[header]
			Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera	Q Imaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera	Q Imaging	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter	Photometrics	DC2
Inverted Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix