Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre

Özet

Iki renkli floresan mikroskop için çift kamera emisyon bölme sistemleri olağanüstü optik ve zamansal çözünürlük, paralel plaka akış odası yapışma deneyleri dahil olmak üzere bazı canlı hücre deneyleri bir şartı ile gerçek-zamanlı görüntü dizileri oluşturmak. Yazılım aynı anda kazanılmış emisyon kanalları görüntüleri birleştirmek için kullanıldığı zaman, yalancı görüntü dizileri üretilir.

Özet

Hücre zarında özel molekülleri tespit etmek için çok renkli, immünofloresan mikroskopi, dinamik akış koşulları altında hücre yapışması ilişkin mekanizmalar incelemektir paralel plaka akış odası deneyleri ile akuple edilebilir. Örneğin, birden fazla florofor ile işaretlenmiş kanser hücrelerinin, kanser metastazının mekanizmaları modellemek için bir potansiyel olarak reaktif alt-tabaka üzerinde perfüze edilebilir. Ancak, gerçek zamanlı canlı hücre analizi için görüntü edinimi çok kanallı tek kamera sistemleri ve renkli kameralar sergi eksiklikleri. Bu sınırlamaları aşmak için, biz aynı anda akış odasına floresan işaretli hücrelerin gerçek zamanlı görüntü dizileri yakalamak için bir çift kamera emisyon bölme sistemi kullanılır. Çift kamera emisyon bölme sistemleri filtre tanımlı dalgaboyu böylece aynı anda iki mekansal özdeş ama flüoroforla özel görüntüleri yakalayan iki monokrom CCD kamera, içine değişmektedir. Daha sonra, psuedocolored tek kanallı görüntüler tek bir birleştirilirGerçek-zamanlı hücreler ilgi bölgede hızla hareket eden birden fazla hedef moleküllerin ortaya çıkarabilir dizisi birleşti.

Giriş

Gibi immun boyama gibi hücre yüzeyi üzerinde moleküllerinin analizi için yöntemler, kimyasal olarak hedef moleküllerin saptanmasına olanak tanıyan, florofor konjuge edilir probları kullanır. Canlı hücre görüntüleme ve hidrodinamik akış tabanlı hücre yapışma deneyleri, tipik olarak, hücre ve / veya moleküler ^{seviyede, 1, 2} fizyolojik süreçleri yakalamak için tasarlanmış tek renkli CCD kamera ile kaydedilir. Bu kameralar hızlı çerçeve oranları (saniyede 30'dan fazla kare) teslim ve (nedeniyle hızlı çerçeve oranları ve kısa pozlama süreleri için) istisnai zamansal çözünürlük sağlayan, son derece duyarlıdır. Ancak, tek renkli kameralar, sadece görüntü toplamak için (bir tek flüorofor tespit) tek bir emisyon kanalı yakalayabilir. Tek kamera emisyon bölme sistemleri birden fazla emisyon kanalları yakalamak için kurulmuştur ama genellikle görüş alanını azaltmak ve tüm kanalları görüntüleme için aynı pozlama süresini gerektirirler. Multip ile etiketlenmiş hücrelerin tam renk spektrumu yakalamak içinle renkli bir kamera, bir alternatif olarak kullanılabilir, flüoroforlar. Bununla birlikte, renk Kameralar bazı uygulamalarda canlı hücre görüntüleme için arzu zamansal çözünürlüğü sağlama genellikle yeteneğine sahip değildir. Başka bir görüntüleme düzeni yüksek bir zamansal çözünürlüğü korurken, birden fazla dalga boyunda görüntü canlı hücre avantajlı olduğu uygulamalar için gereklidir. Bir ilk uygulama deneysel hücreleri, potansiyel olarak reaktif alt-tabaka ^{1, 3} den fazla fizyolojik olarak uygun koşullarda perfüze edildiği paralel plaka akış odası yapışma deneyi, bir. Spesifik hücre yüzey molekülleri ifade akışta hücreler uygun ve bu yapışma molekülleri ya da yüzey-adsorbe hücre dışı matris proteinleri ^{4, 5} eksprese eden bir hücre tek tabaka olarak alt-tabaka üzerinde rulo olabilir. Rolling hücreler saliseler içinde dönme ve öteleme hareketini tabi olabilir. Haddeleme ve bu hücre yüzeyi moleküllerinin kümeleri olarak yapışık hücreler, Moleküler özellikler, aynı zamanda var potentidiğerleri, hücre yüzeyinde aktif bir yeniden geçmesi. Böylece, görüntüleme sistemleri istisnai bir zamansal çözünürlük sağlamak zorundadır (ikinci veya daha yüksek başına 30 kare ve pozlama süreleri "sıfıra yakın") hücre ^{6, 7} haddeleme adım adım ilerlemesini gösteren bir görüntü dizisi oluşturmak için. Çift kamera emisyon bölme sistemleri birden fluorophores etiketli görüntüleme hücreleri için bu talepleri karşılama yeteneğine sahiptirler.

Çift kamera emisyon bölme sistemleri, görüş tam saha korurken aynı anda iki mekansal özdeş ama flüoroforla özel görüntüleri yakalamak için iki benzer kameralar içine filtre floresan kanal bölünmüş ve. Bu teknoloji her kanalda gerçek zamanlı olarak çekilen görüntünün doğrudan karşılaştırılmasını sağlayan ve kullanıcı hızlı bir şekilde farklı görüntüleme yetenekleri ile kamera modelleri arasında geçiş yapmanızı sağlar. Bu özellik, daha iyi sistem yakalamak için izin bir kamera görüntü yakalama ayarları için ayarlamalar yapmak için yararlıdırFarklı yoğunluklarda, yaşamlar, ve sönme katsayıları ⁸ flüoroforlar. Görüntüleme yazılımı ile birleştiğinde, çift kamera emisyon bölme sistemleri, çoklu dalga boyları canlı hücre görüntüleme testlerinin gerçek-zamanlı kayıt izin ve hücre davranışlarını incelemek için floresan kullanmak in vitro deneyleri artırabilir.

Protokol

1.. Yazılım Yükleme

1. StreamPix SimulPix modül veya toplama ve monokrom CCD kameraları tarafından çekilen görüntü birleştirme yeteneğine sahip diğer görüntüleme yazılımı ile 5 Çoklu-Kamera yazılımı satın.
2. StreamPix 5 için minimum gereksinimleri şunlardır: 2 GB RAM veya daha yüksek 2.4 GHz veya daha iyi olan Core 2 Duo ile donatılmış bir PC. Desteklenen bir IEEE dijital veya analog kamera ve uyumlu çerçeve kapmak. , Windows XP/7/Vista 32 veya 64 bit. Çözünürlüğü 1.024 x 768 veya daha yüksek destekleyen bir monitör. Iyi 2D performansı ile bir grafik adaptörü (OCU 16x veya daha iyi ifade önerilir) ve RAID-O yapılandırması ile kayıt için 7,200 RPM sabit disk sürücüsü.

2. İki Renk Eşzamanlı Gerçek zamanlı Görüntüleme Yetenekli Çift Kamera Sistemi Kurulumu

1. MICR video portuna DC2 C-mount adaptör kaydırarak mikroskop DC2 Photometrics emisyon ayırıcı veya benzeri çift kamera emisyon bölme aygıtı bağlayıncihazda dikroik konut erişilebilir şekilde Oscope.
2. Kadın C-montaj 1 içine iki monokrom CCD kamera yerleştirin ve dişi 2 C-montaj. Özdeş kameralar tercih edilir. Benzer kameralar kullanılabilir, ancak uyumluluk iç donanım, en önemlisi CCD görüntü algılayıcı bağlıdır.
3. Her iki kameralardan gelen görüntüleri görüntülemek için görüntüleme yazılımı kullanın. Aşağıdaki adımlar, (2.3.1 - 2.3.4) SimulPix modülü ile StreamPix 5 uygulanır ve diğer çoklu kamera görüntüleme yazılımı için adapte edilmelidir.
   1. Açık StreamPix 5 ve görev şerit "çalışma alanı" seçeneğini seçin.
   2. Aç "çalışma alanı yöneticisi" Ekranın sağında bulunan ve "yeni bir çalışma alanı" seçeneğini seçin.
   3. Bir kamera adlandırma sonra, yazılım önceden doldurulmuş bir listeden bir gaspçı seçmenizi ister izleyin. Kamera modeli eşleşen kapmak seçin ve ikinci kamera çalışma alanı için tekrarlayın. Birleştirilmiş çalışma alanı için, bir kez daha tekrarlayın ancak hata m "tüm kameralar kullanımda"esajı görünecektir. Bu mesaj normaldir.
   4. Birleştirilmiş çalışma yüklendikten sonra, çalışma alanı ve çalışma alanı 1 2 görüntüleme ekranın sağ tarafında bulunan yerleştirme panelinde birleştirilmiş çalışma alanına kamera atama.
4. Çift kamera emisyon bölme sisteminde kameralar hizalayın.
   1. Parlak bir alan veya bir PlanApo 40X objektif (veya daha büyük) kullanarak üretici tarafından sağlanan kalibrasyon ızgara ile faz kontrast kameralar hizalayın.
   2. Mikroskop sahnede üretici tarafından sağlanan metalik kaplamalı kalibrasyon ızgara yerleştirin, mikroskop okülerlerinde ışık göndermek, ve mikroskop sahnede ızgara kare.
   3. Odak haline ızgara getirin.
   4. Yerinden, ama kamera 1 (bypass kamera) hizalamak için, dikroik konut çıkarmayın. Binning olmadan ve autoscaling olmadan ızgara görüntüler. C-mount port 1 odak ayarlama düğmesini kullanarak görüntüyü odaklanın.
   5. Çift kanalını içine dikroik konut itinl toplama cihazı tamamen, görüntü iki kamera için dikroik tarafından bölünmüş şekilde.
   6. Gevşetin üç adet 5/64 "vidalarını ayarlayın ve ızgara yönelim C-montaj port 2 Odak ayar düğmesini kullanarak. Hem görüntü aynıdır kadar kadın C-montaj 2 on ikinci kamerayı döndürmek, kameradan gelen görüntüyü getirmek odak haline 2.
   7. Görüntüleme yazılımı birleştirilmiş çalışma alanında kombine görüntü kullanılarak hizalama tamamlayın. Bu bir kalibrasyon ızgarasının iki görüntülerin gerçek zamanlı Pseudocolor bindirmeyi görmenizi sağlar. DC2 sağ tarafında, sadece R / L düğmesi kullanılarak birleştirilmiş görüntü konumları ayarlayın. Görüntülerin sol / sağ düşey sınır tam hizaya gelene kadar bu düğmeyi ayarlayın.
   8. Yatay ızgara çubukları düzgün hizalanmış kadar ikinci resimdeki yukarı / aşağı hizalamasını ayarlamak için U / D düğmesini kullanın.
   9. Yukarı / aşağı hizalama sırasında hafif bir kamera dönme üç 5/64 "inç scre gevşeterek, doğru bu sorunu ortaya çıkarsaws kamera 2 ve döndürmek için görüntülenen görüntü düzgün hizaya gelene kadar.

3. Paralel Plaka Akış odası Yapışma deneyi için Kanser Hücrelerinin Hazırlanması

1. En az temel ortam (MEM) in kültür BT-20 göğüs kanseri hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin, 37 ° C'de ve _CO2 gibi, daha önce tarif edildiği ² ile% 5.0 'orta tamamlamak için desteklenmiştir.
2. Hasat kanser seyreltilmiş bir tripsin tedavi ile hücreleri ve bir hemositometreyle hücreleri saymak.
3. Yıkama ve kalsiyum ve magnezyum (DPBS +) ile DPBS sığır serumu (BSA)% 0.1 albümin, 10 ⁷ hücre / ml 'de hücrelerin süspansiyonu.
4. % 0.1 BSA DPBS + içinde önceden belirlenmiş bir optimum konsantrasyona kadar, birincil antikor, arıtılmış fare anti-insan CD24 ve saflaştırılmış sıçan HECA-452 (anti-sialofucosylated antijenler) seyreltin. 30 dakika ^{9, 10} hücreleri inkübe edin.
5. 1,200 rpm'de santrifüj hücreleri, bir hücre tanesinin elde edildi. AspiBirincil antikor oranı ve% 0.1 BSA DBPS + ile iki kez hücreleri yıkayın.
6. % 0.1 BSA DPBS + içinde önceden belirlenmiş bir optimum konsantrasyona kadar sekonder antikor, keçi anti-fare IgG AlexaFluor 568 (Emisyon max, 603 nm) ve keçi anti-fare IgM AlexaFluor 488 (Emisyon max, 519 nm) seyreltin. 30 dakika boyunca hücreler inkübe edin.
7. % 0.1 BSA DPBS + 10 ⁶ hücre / ml 'de% 0.1 BSA DPBS + hücreler iki kez yıkayın ve askıya.

4. Paralel Plaka Akış odası Yapışma deneyi için reaktif alt-tabaka hazırlanması

1. Bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde uygun, paralel plaka akış odacığının giriş ve çıkış bağlantı noktaları için bir boru iki ayrı uzunlukları bağlayın. Bir boru belirli bir akış oranında sıvı geri olan şırınga pompası, 0.1% BSA DPBS + ve diğer içinde süspansiyon haline işaretli hücrelerin rezervuar bağlanacaktır.
2. Akış odasına ¹ bir vakum hattı bağlayın.
3. 35 mm doku kültürü di fazla akış odası yerleştirinsh E-selektin (CHO-E) ifade eden Çin hamsteri yumurtalık hücrelerinin bir tek tabaka ihtiva etmektedir. CHO-E hücreleri, 37 ° C'de MEM tam ortam içinde büyütülmüş ve% 5.0 _CO2 ^2. edilmiştir.
4. Yeterli bir vakum sızdırmazlık ¹ sağlamak için akış odasına ve / veya akış odası conta ayarlayın.
5. Uygun mühür ve hava kabarcığı oluşumuna ¹ hiçbir görsel kanıt akış odası takımını izleme, rezervuar sıvı çekin.
6. Mikroskobu (Leica DMI 6000B) üzerinde akış odası düzeneğini ^1.

5. İki renkli Image Acquisition

1. Bir ışık kılavuzu içine yüksek yoğunluklu ışık ve çift bunu oluşturmak için güç bir Leica EL-6000 kompakt ışık kaynağı, ya da benzer bir cihaz. İstediğiniz bir renk / yoğunluğu floroforları heyecanlandırmak için, bir kombinasyon filtre küp, yani G / R (yeşil / kırmızı) filtre küp ile bu ışık geçmek için ters bir mikroskop kullanın.
2. Dikroik konut (depresif) doğru çalışma pozisyonunda ve emin olunbypass modunda değil.
3. Floresan modunda mikroskobu İşlet ve (kırmızı / yeşil) uygun floresan filtre küpü seçin.
4. Kamera 1 pozlama süresini ve kazancını belirlemek (kırmızı; 620 ± 60 nm) ve kamera 2 (yeşil; 535 ± 40 nm).
   1. Hem kırmızı ve yeşil emisyon kanallarında görüntüler elde etmek için dikroik basınız. Sadece kırmızı flüorofor etiketli hücreleri ile bir akış odası deneyi kullanın ve görüntüleme yazılımı "canlı ayarlarında" kamera 1 pozlama süresini ayarlayarak kırmızı kanal bir görüntü elde.
   2. Kameranın 1 pozlama süresi 2 kamerasının pozlama süresini Maç. Bir görüntü yeşil kanal görülürse, akmalarını eserler mevcuttur ve her iki fotoğraf makinesi pozlama süresi azaltılması gerekir.
   3. Akmalarını eserdir artık yeşil kanalda görünür kadar pozlama süresini azaltmak, kamera 1 ve 2 kamerası eşdeğer pozlama süresini tutmak. Görüntü visibilit geliştirmek için kameranın 1 kazancını ayarlayınGerekirse kırmızı kanalda y.
   4. Sadece yeşil floroforuyla etiketli hücreleri ile 5.4.3, ama kamera 1 tarafından toplanan kırmızı kanalda akmalarını eserler olmadan yeşil kanalda görüntü hücrelere kamera 2 ile pozlama süresini tanımlamak - Tekrar 5.4.1 adımları.
   5. Retitrate antikorlar akmalarını eserler ¹¹ elenirse veya kamera 1 ve 2 kamerasının pozlama süreleri önemli ölçüde farklı ise, bu tür görüntüler zamansal hatalı hizalanmış olabilir birleşti ki olamaz.
5. Eş zamanlı akış odası deneyde iki monokrom CCD kameradan çekilen görüntüleri görüntülemek için görüntüleme yazılımı kullanın.
6. StreamPix 5 SimulPix modül veya alternatif bir yazılım paketi kullanarak hem kameralardan alınan görüntüleri birleştirmek.
7. Gerekirse mekansal, birleştirilmiş görüntüleri hizalamak SimulPix veya alternatif yazılım dijital düzeltme ayarlamaları kullanın. Görüntüler yatay, dikey SimulPix modülü ile düzeltilebilirVe dönme ayarlamaları.

Sonuçlar

Bir paralel plaka akış odası yapışma deneyi aynı anda iki emisyon kanallarda gerçek zamanlı görüntü dizileri yakalanan bir çift kamera emisyon bölme sistemi (Şekil 1) göstermek için kullanılmıştır. Çift kamera emisyon bölme sistemi flüoresan anti-insan CD24 ve HECA-452 (sialofucosylated antijenleri tespit) monoklonal antikorlar ve uygun ikincil antikorlar (Şekil 2) ile etiketlenmiş BT-20 hücreleri tespit edildi. Bazı haddeleme hücreler kırmızı sinyaller (C...

Tartışmalar

Çift kamera emisyon bölme sistemi, hücre veya moleküler hareketin hızlı olduğu uygulamalarda yüksek kalitede görüntü yakalamak için gerekli mekansal zamansal ve optik çözünürlüğe sahip. Temsili sonuçlar üreten, yazılım ayarları ve kamera ayarları dahil çift kamera emisyon bölme sistemi, parametreler, haddeleme ve yapışan hücreler mekansal ve zamansal olarak hizalanmış olduğu bir birleştirilmiş görüntü dizisini elde etmek için optimize edilmiştir. Hiza hem yeşil ve kırmızı kanal...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
BT-20 cells	ATCC	HTB-19
CHO-E cells	Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 monoclonal antibody	BD Biosciences	555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody	BD Biosciences	555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
			[header]
			Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera	Q Imaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera	Q Imaging	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter	Photometrics	DC2
Inverted Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix