동시에 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 개의 배출 채널의 실시간 이미지를 캡처 : 응용 프로그램은 접착 셀에

요약

두 가지 색상의 형광 현미경을위한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 뛰어난 광학 및 시간 해상도, 병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석을 포함하여 특정 살아있는 세포 분석의 요구 사항과 실시간 이미지 시퀀스를 생성합니다. 소프트웨어가 동시에 취득한 발광 채널의 이미지를 병합하기 위해 사용될 때, 모조 착색 이미지 시퀀스가​​ 생성된다.

초록

세포막의 특정 분자를 검출하는 다색 면역 형광 현미경 동적 유동 조건 하에서 세포 부착을 규제 메커니즘을 조사하는 평행 판 유동 챔버 분석법으로 연결될 수있다. 예를 들어, 다 형광으로 표지 된 암세포는 암 전이의 메커니즘을 모델링하는 잠재적 반응성 기판을 통해 관류 될 수있다. 그러나 실시간 라이브 세포 분석을위한 이미지 수집의 멀티 채널 단일 카메라 시스템 및 컬러 카메라 전시 단점. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 동시에 유량 용기에 형광 표지 세포의 실시간 이미지 시퀀스를 캡처하는 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용했다. 듀얼 카메라 발광 분할 시스템 필터 정의 파장함으로써 동시에이 공간적으로 동일하지만 형광 특정 화상 촬영이 모노크롬 CCD 카메라로 배열한다. 이어서, psuedocolored 1 채널 이미지는 단일로 결합실시간 세포가 관심 영역에 걸쳐 빠른 속도로 이동하는 여러 표적 분자를 공개 할 수 순서를 합병했다.

서문

이러한 면역 염색과 같은 세포 표면 분자를 분석하는 방법은, 화학적으로 표적 분자의 검출을 허용 형광체에 접합되는 프로브를 사용한다. 라이브 세포 이미징 및 유체 흐름 기반 세포 부착 분석법은 일반적으로 셀룰러 및 / 또는 분자 레벨 ^{1, 2에서} 생리적 과정을 포착하도록 설계된 모노크롬 CCD 카메라로 기록된다. 이 카메라는 빠른 프레임 속도 (초당 30 프레임 이상)을 제공하고, (- 빠른 프레임 속도와 짧은 노출 시간에) 뛰어난 시간 해상도를 제공, 매우 민감하다. 그러나, 흑백 카메라는 이미지를 수집하기 위해 (하나의 형광을 검출) 하나의 배출 채널을 캡처 할 수 있습니다. 단일 카메라 발광 분리 시스템은 다수의 발광 채널을 캡처 혼입하지만 종종 시야를 감소시키고 모든 채널을 이미징하는 동일한 노출 시간을 필요로 할 수있다. multip로 표지 세포의 전체 컬러 스펙트럼을 캡처하려면르는 컬러 카메라가 대안으로 사용될 수 있으며, 형광체. 그러나, 컬러 카메라는 특정 응용 프로그램에서 라이브 셀 이미징에 원하는 시간 해상도를 제공 일반적으로 할 수 없습니다. 또 다른 촬상 장치는 높은 시간 해상도를 유지하면서 다수의 파장에서 이미지 생균에 유익되는 애플리케이션을 위해 필요하다. 주요한 실험 애플리케이션은 세포 잠재적 반응성 기판 ^{1, 3} 위에 생리학 관련 조건으로 관류되는 평행 평판 유동 챔버 부착 분석법이다. 특정 세포 표면 분자를 표현 흐름에있는 세포 접착과 같은 부착 분자 또는 표면 흡착 된 세포 외 기질 단백질 ^{(4, 5)을} 발현하는 세포의 단층으로서 기판 상에 롤있다. 롤링 세포는 두 번째의 분수에 회전 및 병진 운동을 겪을 수있다. 롤링과 같은 세포 표면 분자의 클러스터를 부착 한 세포에 대한 분자의 특징도 potenti있을알은 세포 표면에 활성 개편을 받아야합니다. 따라서, 영상 시스템은 뛰어난 시간 해상도를 제공해야합니다 (초 이상 초당 30 프레임 및 노출 시간 "거의 0") 셀이 ^{6, 7 롤링의} 단계별 진행 상황을 보여줍니다 이미지 시퀀스를 생성 할 수 있습니다. 듀얼 카메라 발광 분리 시스템은 다수의 형광으로 표지 된 세포 이미징을위한 이러한 요구를 충족시킬 수있다.

이중 사진기 방출 분할 시스템보기의 전체 필드를 유지하면서 동시에 두 개의 공간적으로 동일하지만 형광 고유의 이미지를 캡처하는 두 개의 유사한 카메라에 필터 형광 채널을 분할. 이 기술은 각 채널에서 실시간으로 촬영 된 화상의 직접적인 비교를 가능하게하고, 사용자가 신속하게 다른 이미징 기능과 카메라 모델 사이를 전환 할 수있다. 이 기능은 더 나은 시스템을 캡처 할 수있는 하나의 카메라에서 이미지 캡처 설정을 조정하는 데 유용합니다다른 강도, 수명, 그리고 멸종 계수 ⁸ 형광. 이미징 소프트웨어와 결합, 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 여러 파장의 라이브 셀 이미징 분석의 실시간 기록을 허용하고 세포 행동을 연구하기 위해 형광을 사용하여 시험 관내 분석을 향상시킬 수 있습니다.

프로토콜

1. 소프트웨어 설치

1. StreamPix에게 SimulPix 모듈 또는 수집하고 흑백 CCD 카메라로 캡처 한 이미지를 결합 할 수있는 다른 이미징 소프트웨어와 5 멀티 카메라 소프트웨어를 구입합니다.
2. StreamPix 5에 대한 최소 요구 사항은 다음과 같습니다 : 1 기가 바이트 RAM 이상 2.4 GHz의 이상으로 코어 2 듀오를 장착 한 PC를. 지원 IEEE 디지털 또는 아날로그 카메라와 호환 프레임 그래버. 윈도우 XP/7/Vista 32 또는 64 비트. 해상도 1,024 × 768 이상을 지원하는 모니터. 좋은 2D 성능의 그래픽 어댑터 (OCU는 16 배 이상을 표현 권장) 및 RAID-O 구성을 기록 7,200 RPM 하드 디스크 드라이브.

2. 두 가지 색상을 동시에 실시간 이미징 가능 듀얼 카메라 시스템의 설치

1. MICR의 비디오 포트에 DC2 C-마운트 어댑터를 밀어 현미경에 DC2 배광 방출 스플리터, 또는 유사한 듀얼 카메라 방출 분할 장치를 연결합니다장치의 이색의 하우징에 액세스 할 수 있는지 등을 oscope.
2. 여성 C-마운트 (1)에 두 개의 흑백 CCD 카메라를 삽입하고 여성 2 C-마운트합니다. 동일한 카메라가 바람직하다. 유사 카메라가 사용될 수 있지만, 호환성은 내부 하드웨어, 가장 중요한 CCD 이미지 센서에 의존한다.
3. 두 카메라에서 이미지를 표시하는 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 다음 단계 (2.3.1 - 2.3.4) SimulPix 모듈 StreamPix 5에 적용 및 기타 멀티 카메라 이미징 소프트웨어에 적용 할 수 있어야합니다.
   1. 오픈 StreamPix 5 작업 리본에서 "작업 공간"을 선택합니다.
   2. 열기 "작업 공간 관리자"화면의 오른쪽에 위치하며, "새로운 작업 공간"을 선택합니다.
   3. 카메라의 이름을 지정하면, 소프트웨어가 미리 채워진 목록에서 그래버를 선택하라는 메시지를 따르십시오. 카메라 모델과 일치하는 그래버를 선택하고 두 번째 카메라 작업 영역에 대해 반복합니다. 병합 된 작업 공간의 경우, 한 번 더 반복하지만 오류 M "모든 카메라는 사용중인"essage가 나타납니다. 이 메시지는 정상입니다.
   4. 병합 작업 영역이로드되면, 작업 영역 1, 작업 영역 2에서의 뷰잉 스크린의 오른쪽에있는 도킹 패널 병합 작업 영역에 카메라를 할당.
4. 듀얼 카메라 방출 분할 시스템에 카메라를 맞 춥니 다.
   1. 밝은 필드 또는 PlanApo 40X 목표 (또는 그 이상)를 사용하여 제조 업체에서 제공하는 교정 그리드와 위상 대조적으로 카메라를 맞 춥니 다.
   2. 현미경 단계에 제조업체에서 제공 한 금속 코팅 보정 그리드를 배치, 현미경의 접안 렌즈로 빛을 전송하고, 현미경의 무대에서 그리드를 광장.
   3. 초점 그리드를 가져옵니다.
   4. 치환하지만, 카메라 1 (수동 카메라)를 정렬, 이색 주택을 제거하지 마십시오. 비닝없이 자동으로 조정하지 않고 그리드를 표시합니다. C-마운트 포트 1에 포커스 조절 다이얼을 사용하여 이미지를 초점.
   5. 이중 channe에 이색 주택을 눌러L 취득 장치에 완전히 이미지가 모두 카메라에 다이크로 분할되도록.
   6. 푸 세 64분의 5 "나사를 설정하고 격자의 방향이 C-마운트 포트 2에 초점 조절 다이얼을 사용하여. 두 이미지에 동일한 때까지 여성 C-마운트에 대한 두 번째 카메라를 회전, 카메라에서 이미지를 가져 초점 2.
   7. 이미징 소프트웨어의 병합 된 작업 공간에 결합 된 화상을 이용하여 얼라인먼트를 마무리. 이것은 하나 보정 그리드의 두 영상의 실시간 의사 색조 오버레이를 참조 할 수있다. DC2의 우측에만 R / L 노브를 사용하여 조합 된 이미지의 위치를​​ 조정한다. 이미지의 왼쪽 / 오른쪽 수직 경계가 정확하게 정렬 될 때까지이 노브를 조정합니다.
   8. 수평 눈금 막대가 제대로 정렬 될 때까지 두 번째 이미지의 위 / 아래 정렬을 조정하기 위해 U / D 노브를 사용합니다.
   9. 위 / 아래 정렬하는 동안 약간의 카메라 회전은 세 64분의 5 "인치 SCRE를 풀어, 올바른이 문제가 발생하는 경우WS 카메라 2 회전에 표시된 이미지가 제대로 정렬 될 때까지.

3. 평행 판 유량 용기 접착 분석에 대한 암 세포의 준비

1. 최소 필수 배지 (MEM)에서 배양 BT-20 유방암 세포는 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 37 ° C에서와 CO _2는 앞서 ² 바와 5.0 %로 매체를 완료 보충.
2. 수확 암 묽은 트립신 처리를 가진 세포는 혈구와 세포를 계산합니다.
3. 세척 및 칼슘 및 마그네슘 (DPBS +)와 DPBS에서 소 혈청 (BSA)에서 0.1 % 알부민 10 ⁷ 세포 / ml로 세포를 일시.
4. 0.1 % BSA DPBS +에서 소정의 최적의 농도로, 기본 항체 정제 된 마우스 항 - 인간 CD24 정제 쥐 HECA-452 (안티 sialofucosylated 항원)을 희석. 30 분 ^{9, 10에} 대한 세포를 품어.
5. 1,200 rpm에서 원심 분리기 세포 세포 펠렛을 구하십시오. ASPI일차 항체를 평가하고, 0.1 % BSA, admin으로 +로 두 번 세포를 씻으십시오.
6. 0.1 % BSA DPBS + 소정 최적의 농도 차 항체, 염소 항 - 마우스 IgG AlexaFluor 568 (방출 최대 603 NM), 및 염소 항 - 쥐의 IgM AlexaFluor 488 (방출 최대, 519 nm의), 희석. 30 분 동안 세포를 품어.
7. 0.1 % BSA DPBS + 10 ⁶ 세포 / ml에서 0.1 % BSA DPBS +에 두 번 세포를 세척하고 일시 중지합니다.

4. 평행 판 유량 용기 접착 분석에 대한 반응성 기판의 제조

1. 35mm 조직 배양 접시 안에 맞는 평행 판 유량 용기의 입구와 출구 포트에 튜브 두 개의 길이를 연결합니다. 한 튜브는 지정된 유량 유체를 철회 할 주사기 펌프, 0.1 % BSA DPBS +와 다른 정지 표지 세포의 저장소에 연결됩니다.
2. 유량 용기 ¹ 진공 라인을 연결합니다.
3. 35mm 조직 배양 디에 유량 용기의 위치를SH E-셀렉틴 (E-CHO)를 발현하는 중국어 햄스터 난소 세포의 단층을 함유. CHO-E 세포는 37 ° C에서 MEM 완전 배지에서 성장과 5.0 %의 CO ^_2했다.
4. 적절한 진공 밀봉 ^1을 보장하기 위해 유량 용기 및 / 또는 흐름 챔버 가스켓을 조정합니다.
5. 적절한 도장과 기포 형성 ^(1)의 더 시각적 인 증거를 유량 용기 어셈블리를 모니터링, 저수지에서 유체를 철회.
6. 현미경 (라이카 DMI 6000B)에 유량 용기 어셈블리를 놓고 ^1.

5. 두 가지 색의 이미지 수집

1. 라이트 가이드에 높은 강도의 빛과 쌍을 생성하는 전원 라이카 EL-6000 소형 광원, 또는 유사한 장치. 원하는 색 / 강도의 형광 물질을 자극하기 위해, 조합 필터 큐브, 즉 G / R (그린 / 레드) 필터 큐브를 통해 빛을 통과 거꾸로 현미경을 사용합니다.
2. 이색 하우징 (우울) 올바른 운영 위치에 있고 확인바이 패스 모드에 있지.
3. 형광 모드에서 현미경을 운영하고 (빨강, 녹색 /) 적절한 형광 필터 큐브를 선택합니다.
4. 카메라 1의 노출 시간과 이득 결정 (적색, 620 ± 60 nm의) 카메라 2 (녹색, 535 ± 40 nm 정도).
   1. 모두 적색 및 녹색 발광 채널의 이미지를 얻기 위해 이색 우울. 단지 적색 형광 물질로 표지 된 세포와 유동 챔버 분석을 사용하여 이미징 소프트웨어의 "라이브 설정"에서 카메라 (1)의 노광 시간을 조정하여 적색 채널에 화상을 얻었다.
   2. 카메라 1의 노출 시간에 2 번 카메라의 노출 시간을 맞 춥니 다. 이미지는 녹색 채널에서 관찰되는 경우, 블리드 - 스루 아티팩트가 존재하고 두 카메라의 노출 시간이 감소 될 필요가있다.
   3. 비쳐 아티팩트가 더 이상 녹색 채널에 보일 때까지 노출 시간을 감소시키지 카메라 1과 카메라 2에 상응하는 노출 시간을 유지. 이미지 visibilit을 개선하기 위해 카메라 1의 게인을 조정필요한 경우 빨간색 채널 Y.
   4. 단지 녹색 형광으로 표지 된 세포와 5.4.3하지만, 카메라 (1)에 의해 수집 된 빨강 채널에서 비쳐 유물없이 녹색 채널의 이미지 셀에 카메라 2 노출 시간을 정의 - 반복 5.4.1 단계를 반복합니다.
   5. Retitrate 항체 비쳐 유물 ^(11)를 제거하거나 카메라 1과 카메라 2의 노출 시간이 상당히 다른 경우 예를 들어, 이미지가 일시적으로 잘못 정렬 될 수 있습니다 합병이 할 수없는 경우.
5. 동시에 흐름 챔버 실험에서 두 개의 흑백 CCD 카메라에서 촬영 된 이미지를 볼 수 이미징 소프트웨어를 사용합니다.
6. Streampix 5 SimulPix 모듈 또는 다른 소프트웨어 패키지를 사용하여 두 카메라에서 수집 한 이미지를 병합합니다.
7. 필요한 경우 공간적으로, 병합 된 이미지를 정렬 SimulPix 또는 다른 소프트웨어의 디지털 보정 조정을 사용합니다. 이미지는 수평, 수직의 SimulPix 모듈을 보정 할 수있다, 및 회전 조정.

결과

병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석은 동시에 두 개의 발광 채널에서 실시간 이미지 시퀀스를 캡처 한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템 (그림 1)를 설명하는 데 사용되었다. 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 형광 항 - 인간 CD24과 HECA-452 (sialofucosylated 항원을 검출) 단일 클론 항체 및 적절한 보조 항체 (그림 2)으로 표시 한 BT-20 세포를 발견했습니다. 일부 압연 세포가 빨간 신?...

토론

듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 세포 또는 분자 운동이 급속 응용 프로그램에서 높은 품질의 이미지를 캡처하는 데 필요한, ​​공간 시간 및 광학 해상도를 가지고 있습니다. 대표적인 결과를 생성, 소프트웨어 설정 및 카메라 설정을 포함하여 듀얼 카메라 방출 분할 시스템의 매개 변수는, 압연 부착 세포가 공간적으로 시간적으로 정렬 된에 병합 된 이미지 시퀀스를 얻기 위해 최적화되었다. ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
BT-20 cells	ATCC	HTB-19
CHO-E cells	Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 monoclonal antibody	BD Biosciences	555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody	BD Biosciences	555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
			[header]
			Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera	Q Imaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera	Q Imaging	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter	Photometrics	DC2
Inverted Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix