Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular

Resumo

Sistemas de divisão de emissão dupla de câmera para microscopia de fluorescência de duas cores gerar seqüências de imagens em tempo real com resolução óptica e temporal excepcional, uma exigência de determinados ensaios de células ao vivo, incluindo ensaios de adesão câmara de fluxo de placas paralelas. Quando o software é utilizado para fundir imagens de canais de emissão adquiridas simultaneamente, seqüências de imagens pseudocolored são produzidos.

Resumo

A microscopia de imunofluorescência multi-color para detectar moléculas específicas na membrana da célula pode ser acoplado com os ensaios de câmara de fluxo paralelo à placa de investigar os mecanismos que regulam a adesão de células em condições de escoamento dinâmico. Por exemplo, as células cancerosas marcadas com vários fluoróforos podem ser perfundidos sobre um substrato potencialmente reativo para modelar mecanismos de metástase do câncer. No entanto, multi-canal de sistemas únicos de câmera e câmeras coloridas deficiências apresentam na aquisição de imagens para análise de células vivas em tempo real. Para superar essas limitações, foi utilizado um sistema de separação de emissão de câmara dupla de capturar simultaneamente sequências de imagens em tempo real de células marcadas com fluorescência na câmara de fluxo. Comprimento de onda do filtro sistemas de divisão de emissão dupla de câmera definido varia em duas câmeras CCD monocromático, capturando, assim, simultaneamente duas imagens idênticas, mas espacialmente específicas do fluoróforo. Subsequentemente, psuedocolored imagens de um canal são combinados numa únicaem tempo real fundiu seqüência que pode revelar várias moléculas-alvo em células movendo-se rapidamente através de uma região de interesse.

Introdução

Os métodos para análise de moléculas na superfície das células, tais como a imunocoloração, empregam sondas que são quimicamente conjugados com fluoróforos, permitindo a detecção de moléculas alvo. Imagens de células vivas e ensaios de adesão de células baseadas no fluxo hidrodinâmicas são gravadas com câmeras CCD monocromático projetado para capturar os processos fisiológicos a nível celular e / ou molecular ^{1, 2.} Essas câmeras são altamente sensíveis, entregar taxas de quadro rápidas (mais de 30 quadros por segundo), e fornecer resolução temporal excepcional (devido a taxas de quadro rápidas e tempos de exposição curto). No entanto, as câmeras monocromáticas só pode capturar um único canal de emissão (a detecção de um único fluoróforo) para coletar imagens. Sistemas de divisão de emissão de uma única câmara podem ser incorporados para captar vários canais de emissão, mas muitas vezes reduzir o campo de visão e exigem o mesmo tempo de exposição para a imagem de todos os canais. Para capturar o espectro de cores a partir de células marcadas com multiple fluoróforos, uma câmara de cor pode ser usado como alternativa. No entanto, câmeras de cor geralmente não são capazes de fornecer a resolução temporal desejado para imagens de células vivas em determinadas aplicações. Outro dispositivo de imagem é necessária para aplicações em que é vantajosa a imagem de células vivas em vários comprimentos de onda, mantendo uma alta resolução temporal. Uma aplicação experimental principal é o ensaio de adesão de câmara de fluxo de placas paralelas, em que as células são perfundidos em condições fisiologicamente relevantes sobre um substrato potencialmente reactiva ^{1, 3.} As células em fluxo que expressam moléculas da superfície celular específicos podem aderir e rolo sobre o substrato, tal como uma monocamada de células que expressam as moléculas de adesão ou de proteínas extracelulares adsorvido à superfície da matriz ^{4, 5.} Rolando células podem sofrer movimento de rotação e de translação em frações de segundo. Características moleculares sobre rolamento e células aderentes, tais como aglomerados de moléculas de superfície celular, também têm o potenciômetroal de sofrer reorganização activa na superfície da célula. Assim, sistemas de imagem deve fornecer uma resolução temporal excepcional (30 quadros por segundo ou mais, e "quase zero" tempos de exposição) para gerar uma seqüência de imagens que ilustra a progressão passo-a-passo de célula rolando ^{6, 7.} Sistemas de divisão de emissão câmera dupla são capazes de atender a essas demandas para a imagem latente células marcadas com vários fluoróforos.

Sistemas de divisão de emissão câmera dupla dividir e canais de fluorescência do filtro em duas câmeras semelhantes de capturar simultaneamente duas imagens idênticas, mas espacialmente específicos de fluoróforo, mantendo o pleno campo de visão. Esta tecnologia permite a comparação direta da imagem capturada em tempo real em cada canal e permite ao usuário alternar rapidamente entre os modelos de câmeras com diferentes capacidades de imagem. Esse recurso é útil para fazer ajustes nas configurações de captura de imagem em uma câmera que melhor permitem que o sistema para capturarfluoróforos com diferentes intensidades, vidas, e coeficientes de extinção ^8. Juntamente com o software de imagem, sistemas de divisão de emissão da câmera dupla permite a gravação em tempo real de ensaios de imagens de células vivas em vários comprimentos de onda e pode aumentar a ensaios in vitro que utilizam a fluorescência para estudar o comportamento das células.

Protocolo

1. Instalação de Software

1. Compre StreamPix 5 software multi-câmera com módulo SimulPix ou outro software de imagem capaz de coletar e combinar imagens captadas por câmeras CCD monocromática.
2. Os requisitos mínimos para StreamPix 5 incluem: Um PC equipado com Core 2 Duo com 2.4 GHz ou superior, com 2 GB de RAM ou superior. Uma câmera digital ou analógico IEEE apoiado e compatível placa de captura. O Windows XP/7/Vista 32 ou 64 bits. Um monitor com suporte para resolução 1024 x 768 ou superior. Um adaptador gráfico com bom desempenho 2D (OCU Express 16x ou melhor é recomendado) e 7.200 RPM disco rígido para gravar com configuração RAID-O.

2. Instalação de sistema de câmera dupla capaz de duas cores simultâneas em tempo Real Imaging

1. Conecte o divisor DC2 Photometrics emissão, ou semelhante dispositivo câmera dupla divisão de emissões, ao microscópio, deslizando o adaptador DC2 C-mount na porta de vídeo do microscope de tal modo que a carcaça da dicróico no dispositivo é acessível.
2. Insira duas câmeras CCD monocromático em fêmea de montagem C 1 e C-mount fêmea 2. Câmeras idênticas são preferíveis. Câmaras similares podem ser utilizados, mas a compatibilidade depende do hardware interno, o mais importante o sensor de imagem CCD.
3. Use software de imagem para exibir imagens de ambas as câmaras. Os passos seguintes (2.3.1 - 2.3.4) aplicam-se a StreamPix 5 com módulo SimulPix e deve ser adaptada para outro software de imagem multi-câmera.
   1. Abrir StreamPix 5 e selecione "espaço de trabalho" na fita tarefa.
   2. Abrir "gerente da área de trabalho", localizada na extremidade direita da tela e selecione "novo espaço de trabalho".
   3. Depois de nomear uma câmera, siga software pede para selecionar um capturador de uma lista pré-preenchida. Selecione o grabber combinando o modelo da câmera e repita para o segundo espaço de trabalho da câmara. Para a área de trabalho mesclado, repito mais uma vez, mas "todas as câmeras estão em uso" erro mENSAGEM aparecerá. Esta mensagem é normal.
   4. Uma vez que o espaço de trabalho resultante da fusão é carregado, atribuir câmeras de espaço de trabalho um espaço de trabalho e 2 para o espaço de trabalho incorporada no painel de encaixe localizado no lado direito do ecrã de visualização.
4. Alinhe as câmeras no sistema de separação, emissão câmera dual.
   1. Alinhar as câmaras em campo brilhante ou de contraste de fase com a grelha de calibração fornecidas pelo fabricante, utilizando uma objectiva 40X PlanApo (ou maior).
   2. Enviar luz para as oculares do microscópio, coloque a grelha de calibração revestido de metal que foi fornecida pelo fabricante no palco microscópio e Praça da grade no palco microscópio.
   3. Traga a grade em foco.
   4. Deslocar, mas não remova, o alojamento dicróica para alinhar a câmera 1 (câmera manual). Exibir a grade sem binning e sem autoscaling. Foque a imagem usando o botão de ajuste de foco no porta C-mount 1.
   5. Empurrar a caixa para o duplo dicróico Circuitosl dispositivo de aquisição totalmente, de modo que a imagem é dividida pelo dicróico para ambas as câmaras.
   6. Solte os três 5/64 "set parafusos e gire a segunda câmera na fêmea de montagem C 2 até que a orientação da rede é idêntico em ambas as imagens. Usando o botão de ajuste do foco em C-mount porta 2, trazer a imagem da câmera 2 em foco.
   7. Finalize o alinhamento usando a imagem combinada no espaço de trabalho resultante da fusão do software de imagem. Isto permite que se veja uma pseudo sobreposição em tempo real das duas imagens da grelha de calibragem. Ajustar a posição da imagem combinados utilizando apenas o botão R / L, no lado direito da DC2. Ajuste este botão até que limite vertical direita / esquerda das imagens é precisamente alinhadas.
   8. Use o botão L / D para ajustar o alinhamento up / down da segunda imagem até que as barras da grade horizontal estão devidamente alinhados.
   9. Se durante o alinhamento para cima / baixo uma ligeira rotação da câmera ocorre, corrigir este problema, soltando os três 5/64 "polegadas screws para câmera de 2 e gire até que a imagem exibida está bem alinhada.

3. Preparação de células de câncer de placas paralelas de fluxo Câmara Adesão Assay

1. Culturas células BT-20 do cancro da mama em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com meio completo com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C e 5,0% de CO _2, como descrito anteriormente ^2.
2. Células de câncer de colheita com um tratamento diluída tripsina e contagem de células com um hemocitômetro.
3. Lavar e suspender as células em 10 ⁷ células / ml em 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) em DPBS com cálcio e magnésio (DPBS +).
4. Dilui-se os anticorpos primários, ratinho purificada CD24 anti-humano e de rato purificada HECA-452 (anti-antigénios sialofucosylated), a uma concentração óptima predeterminada de 0,1% BSA DPBS +. Incubar as células durante 30 minutos ^{9, 10.}
5. Células centrifugar a 1.200 rpm para obter um pellet de células. Aspiclassificar o anticorpo primário, e lavar as células duas vezes com 0,1% de BSA DBPS +.
6. Dilui-se anticorpos secundários, de cabra anti-IgG de ratinho AlexaFluor 568 (emissão máxima, 603 nm), e de cabra anti-IgM de rato AlexaFluor 488 (emissão máxima, 519 nm), a uma concentração óptima predeterminada de 0,1% BSA DPBS +. Incubar as células durante 30 min.
7. Lave as células duas vezes e suspensão em 0,1% de BSA DPBS + a 10 ⁶ células / ml em 0,1% BSA DPBS +.

4. Preparação de Reactive Substrato para Placa Paralela Fluxo Câmara Adesão Assay

1. Conectar dois comprimentos separados de tubo para as portas de entrada e de saída da câmara de fluxo de placas paralelas que se encaixa dentro de 35 mm de cultura de tecidos prato. Um tubo vai ligar ao reservatório de células marcadas em suspensão em 0,1% de BSA DPBS + e o outro para a bomba de seringa, que irá retirar o fluido a uma taxa de fluxo especificada.
2. Ligar uma linha de vácuo para a câmara de fluxo ^1.
3. Posicione a câmara de fluxo ao longo de 35 mm de cultura de tecidos dish contendo uma monocamada de células de ovário de hamster chinês que expressam E-selectina (CHO-E). As células CHO-E foram cultivadas em meio completo MEM a 37 ° C e 5,0% de CO ₂ ^2.
4. Ajustar a câmara de fluxo e / ou junta câmara de fluxo para assegurar um selo de vácuo adequada ^1.
5. Retire fluido do reservatório, monitoramento da montagem de câmara de fluxo para vedação adequada e nenhuma evidência visual de formação de bolhas de ar ^1.
6. Coloque o conjunto câmara de fluxo em microscópio (Leica DMI 6000B) ^1.

5. Duas cores Aquisição de Imagem

1. Poder fonte Leica EL-6000 luz compacta, ou dispositivo similar, para gerar luz de alta intensidade e par-a em um guia de luz. Use um microscópio invertido para passar esta luz através de um filtro de combinação do cubo, ou seja, G / R (verde / vermelho) cubo de filtro, para excitar fluoróforos de uma cor / intensidade desejada.
2. Certifique-se de habitação dicróica está na posição correcta de funcionamento (deprimido) enão está no modo manual.
3. Operar microscópio de fluorescência no modo e selecionar adequada cubo de filtro de fluorescência (verde / vermelho).
4. Determinar o tempo de exposição e ganho de câmera 1 (vermelho, 620 ± 60 nm) e câmera de 2 (verde; 535 ± 40 nm).
   1. Pressione a dicróica para obter imagens em ambos os canais de emissão de vermelho e verde. Usar um ensaio de câmara de fluxo com células marcadas com apenas o fluoróforo vermelho, e obter uma imagem no canal vermelho, ajustando o tempo de exposição da câmara 1 em "configurações vivo" do software de imagem.
   2. Combine o tempo de exposição de 2 a câmera o tempo de exposição da câmera 1. Se uma imagem é observada no canal verde, artefactos de purga estão presentes e tempo de exposição, em ambas as câmaras tem de ser reduzida.
   3. Manter o tempo de exposição equivalente em câmera 1 e câmera de 2, reduzir o tempo de exposição até que o artefato de sangria-through não é mais visível no canal verde. Ajuste o ganho da câmera 1 para melhorar a imagem visibility no canal vermelho, se necessário.
   4. Repita os passos 5.4.1 - 5.4.3 com células marcadas apenas com o fluoróforo verde, mas definir o tempo de exposição com a câmera de 2 a células de imagem no canal verde, sem artefatos sangram-through no canal vermelho coletadas pela câmera 1.
   5. Anticorpos Retitrate se artefatos sangram-through não podem ser eliminados ^11, ou se os tempos de exposição da câmera e uma câmera de 2 são substancialmente diferentes de tal forma que se fundiu imagens podem ser temporariamente desalinhado.
5. Use um software de imagem para visualizar as imagens capturadas simultaneamente a partir de duas câmeras CCD monocromático no experimento câmara de fluxo.
6. Mesclar imagens recolhidas a partir de ambas as câmaras, utilizando o módulo de SimulPix Streampix 5 ou um pacote de software alternativo.
7. Use ajustes de correção digitais em SimulPix ou software alternativo para alinhar espacialmente as imagens incorporadas, se necessário. As imagens podem ser corrigidos com o módulo SimulPix para horizontal, verticale ajustes de rotação.

Resultados

Um ensaio de adesão câmara de fluxo de placas paralelas foi utilizado para demonstrar um sistema de separação de emissão de câmara dupla que simultaneamente capturado sequências de imagens em tempo real em dois canais de emissão (Figura 1). O sistema de separação de emissão de câmara dupla detectado células BT-20, que foram marcadas por fluorescência com CD24 anti-humano e HECA-452 (detecção de antigénios sialofucosylated) anticorpos monoclonais e anticorpos secundários adequados

Discussão

O sistema de separação de emissão de câmara dupla tem a resolução espacial, temporal e óptica necessária para capturar imagens de alta qualidade em aplicações onde a célula ou o movimento molecular é rápido. Em gerando os resultados representativos, os parâmetros do sistema de separação de emissão de câmara dupla, incluindo as configurações de software e as configurações da câmera, foram otimizados para obter uma sequência imagem mesclada em que rolamento e as células aderentes foram espacialmen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
BT-20 cells	ATCC	HTB-19
CHO-E cells	Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 monoclonal antibody	BD Biosciences	555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody	BD Biosciences	555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
			[header]
			Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera	Q Imaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera	Q Imaging	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter	Photometrics	DC2
Inverted Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix