Одновременно Захват изображения в реальном времени в двух выбросов каналов Использование Разделение системы двойной камеры выбросов: Заявки на клеточной адгезии

Резюме

Двойная камера выбросов системы расщепления для двухцветной флуоресцентной микроскопии генерировать в реальном времени последовательности изображений с исключительной оптической и временным разрешением, требования некоторых живых клеток анализов в том числе параллельных Проточная камера пластина адгезии анализов. Когда программное обеспечение используется для объединения изображений с одновременно приобретенных каналов выбросов, псевдоцветной последовательности изображений производятся.

Аннотация

Многоцветный иммунофлюоресценции микроскопии для обнаружения специфических молекул в мембране клетки могут быть связаны с параллельными камерных поток пластина анализов для исследования механизмов, регулирующих клеточную адгезию в динамических условиях потока. Например, раковые клетки, меченные нескольких флуорофорами можно перфузии над потенциально реактивной субстрат для моделирования механизмов раковых метастаз. Тем не менее, многоканальные системы одной камеры и цветные камеры проявляют недостатки в получения изображений для анализа в реальном времени живых клеток. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы использовали двойной камеры выбросов систему расщепления одновременно захватить в режиме реального времени изображения последовательности флюоресцентно меченых клеток в камере потока. Выбросов системы расщепления двойной камеры фильтр определен диапазонов длин волн на две монохромный ПЗС-камер, тем самым одновременно захватив два пространственно одинаковые, но флуорофорные конкретных изображений. Впоследствии psuedocolored изображения одноканальные объединены в одинв режиме реального времени последовательность, которая может выявить несколько молекул-мишеней на клетки быстро движется по интересующей области объединены.

Введение

Методы анализа молекул на поверхности клеток, таких как иммунным окрашиванием, использовать зонды, которые химически конъюгированных с флуорофоров, что позволяет обнаруживать молекул-мишеней. Живая клетка изображений и гидродинамического потока на основе клеточной адгезии анализы обычно записываются с монохромными ПЗС-камер, предназначенных для захвата физиологические процессы на клеточном и / или молекулярном уровне ^{1, 2.} Эти камеры обладают высокой чувствительностью, доставить высокую частоту кадров (более 30 кадров в секунду), и обеспечивают исключительную временное разрешение (в связи с высокой частотой смены кадров и коротким временем воздействия). Тем не менее, черно-белых камер можно только захватить один канал эмиссии (обнаружения одного флуорофора) для сбора изображений. Холост системы расщепления выбросов камера может быть включена, чтобы захватить несколько каналов выбросов, но часто уменьшить поле зрения и требуют такого же времени экспозиции для визуализации всех каналов. Для захвата полный цветовой спектр из клеток, меченных MULTIPле флуорофоры, цветная камера может использоваться в качестве альтернативы. Тем не менее, цветные камеры обычно не способны обеспечить требуемую временное разрешение для живого изображения клетки в определенных приложениях. Другое устройство формирования изображения необходим для приложений, в которых целесообразно изображений живых клеток на множественных длинах волн, сохраняя высокое временное разрешение. Ярким экспериментальный приложение является параллельной проточной камеры пластина адгезия анализ, в котором клетки перфузии в физиологически соответствующих условий в течение потенциально реакционноспособного подложки ^{1, 3.} Клетки, которые экспрессируют потока специфические молекулы клеточной поверхности могут прилипать и рулон на подложке, такой как клеточный монослой экспрессии молекул адгезии или поверхностно-адсорбированный белки внеклеточного матрикса ^{4, 5.} Прокатные клетки могут пройти вращения и поступательное движение в доли секунды. Молекулярные особенности на прокатки и адгезивных клеток, таких как кластеры молекул клеточной поверхности, также имеют потенциометраль пройти активное реорганизации на поверхности клетки. Таким образом, системы визуализации должны предоставить исключительное временное разрешение (30 кадров в секунду или более и "около нуля" время экспозиции) для создания последовательности изображений, которая иллюстрирует шаг за шагом прогрессирование клеток прокатки ^{6, 7.} Системы расщепления выбросов Двойная камера способна удовлетворить эти требования для работы с изображениями клетки помечены с несколькими флуорофорами.

Системы расщепления выбросов Двойная камера разделена и флуоресценции фильтр каналов в двух аналогичных камер одновременно захватить два пространственно одинаковые, но флуорофорные конкретных изображений, сохраняя при этом полный обзор. Эта технология позволяет прямое сравнение изображения, снятого в режиме реального времени в каждом канале и позволяет пользователю быстро переключаться между моделями камер с различными возможностями визуализации. Эта функция полезна для внесения изменений в настройки захвата изображения в одной камере, что лучше позволить системе, чтобы захватитьфлуорофоры с разной интенсивностью, жизни и коэффициентов экстинкции ^8. В сочетании с ПО для обработки изображений, двойные выбросов системы расщепления камеры позволяют в режиме реального времени записи живых анализов изображений клеток в нескольких длинах волн и может повысить анализов в пробирке, которые используют флуоресценцию изучать поведение клеток.

протокол

1. Установка программного обеспечения

1. Покупка StreamPix 5 программное обеспечение Multi-Camera с модулем SimulPix или другого ПО для обработки изображений, способной сбора и объединения изображений, полученных монохромный ПЗС-камер.
2. Минимальные требования к StreamPix 5 включают в себя: ПК, оснащенный Core 2 Duo с частотой 2,4 ГГц или лучше с 2 Гб оперативной памяти или выше. Поддерживается IEEE цифровой или аналоговой камеры и совместимо захвата кадров. Окна XP/7/Vista 32 или 64 бит. Монитор с поддержкой разрешения 1024 х 768 или выше. Графический адаптер с хорошим 2D производительности (OCU выразить 16x или выше рекомендуется) и 7200 оборотов в минуту жесткий диск для записи с конфигурацией RAID-вывода.

2. Установка двойной системой камера, способная двухцветный Одновременная реального времени изображений

1. Подключите сплиттер DC2 Фотометрия выбросов, или подобный расщепления выбросов двойная камера устройства, к микроскопом, сдвинув адаптер DC2 C-Mount в видео порту микрoscope таким образом, что корпус из дихроичного на устройстве доступен.
2. Вставьте две монохромный ПЗС камеры в женской C-Mount 1 и женщина С-крепление 2. Идентичные камеры являются предпочтительными. Подобные камеры могут быть использованы, но совместимость зависит от внутренней аппаратных средств, что наиболее важно матрицы ПЗС.
3. Используйте для обработки изображений для отображения изображения с обеих камер. Следующие шаги (2.3.1 - 2.3.4) применяются к StreamPix 5 с модулем SimulPix и должны быть адаптированы для других программ визуализации нескольких камер.
   1. Открыть StreamPix 5 и выберите пункт "рабочее пространство" на ленте задач.
   2. Открыть "Workspace Manager" расположен в правой части экрана и выберите пункт "новое рабочее пространство".
   3. После присвоения камеру, следуйте программа предложит выбрать граббер от предварительно населенном списка. Выберите граббер, соответствующую модель камеры и повторите для второго камеры рабочего пространства. Для объединенной рабочей области еще раз повторить, но "все камеры находятся в использовании" ошибка мessage появится. Это сообщение является нормальным.
   4. После того, как объединенная рабочая загружается, назначить камеры от рабочей области 1 и рабочей области 2 к объединенной рабочей в док-панели, расположенной на правой стороне экрана просмотра.
4. Совместите камеры в двойной камеры выбросов системы расщепления.
   1. Совместите камеры в светлом поле или фазового контраста с калибровочной сетки, представленной изготовителем с использованием цели Planapo 40X (или больше).
   2. Отправить свет микроскопа окуляров, поместите металлическую покрытием калибровочной сетки, которая была предоставлена ​​производителем на столик микроскопа и квадрат сетки на столик микроскопа.
   3. Принесите сетку в фокусе.
   4. Свернуть, но не снимайте, дихроичного жилье для выравнивания камеры 1 (байпас камеры). Отобразите сетку без биннинга и без авто-масштабирования. Сфокусируйтесь на изображении с помощью регулировки фокуса диск на С-горе порта 1.
   5. Нажмите дихроичное жилье в двойной каналл приобретение устройство полностью, так что изображение делится на дихроичного в обеих камерах.
   6. Ослабить три 5/64 "установочные винты и повернуть второй камеры на женской C-Mount 2 до тех пор, ориентация сетки не идентичен в обоих изображений. Использование регулировки фокуса диск на C-Mount порт 2, довести изображение с камеры 2 в фокус.
   7. Завершение выравнивание с использованием комбинированного изображения в объединенной рабочей области обработки изображений. Это позволяет видеть в режиме реального времени псевдо наложения двух изображений калибровочной сетки. Регулировка объединенные положение изображения, используя только R / L ручку на правой стороне DC2. Отрегулируйте этот регулятор, пока правая / левая вертикальная граница изображений не точно выровнены.
   8. Используйте U / D регулятором вверх / вниз выравнивание втором изображении, пока турники сетки не были должным образом увязаны.
   9. Если во время вверх / вниз выравнивания небольшое вращение камеры происходит, правильно этот вопрос, ослабив три 5/64 "дюймовые ScreWS для камеры 2 и вращать, пока изображение на экране не будет выровнен.

3. Подготовка раковых клеток для параллельных пластин проточной камеры адгезии Пробирной

1. Культура BT-20 клетки рака молочной железы в минимальной необходимой среде (MEM), дополненной в полной среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина при 37 ° С и 5,0% CO _2, как описано выше ^2.
2. Урожай раковые клетки с обработкой разбавленной трипсина и подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
3. Мытье и приостановить клеток в 10 ⁷ клеток / мл в 0,1% альбумина бычьей сыворотки из (BSA) в DPBS с кальцием и магнием (DPBS +).
4. Развести первичных антител, очищенного мышиного антитела против человеческого CD24 и очищают крысы HECA-452 (анти-sialofucosylated антигены), до заданной оптимальной концентрации в 0,1% BSA DPBS +. Инкубируйте клетки в течение 30 мин ^{9, 10.}
5. Центрифуга клетки при 1200 оборотах в минуту, чтобы получить осадок клеток. Аспиоценить первичное антитело, и мыть клетки дважды с 0,1% BSA ППД +.
6. Развести вторичные антитела, антимышиного IgG AlexaFluor 568 (эмиссия макс, 603 нм), а также козы против крыс IgM AlexaFluor 488 (эмиссия макс, 519 нм), с заданной оптимальной концентрации в 0,1% BSA DPBS +. Инкубируйте клетки в течение 30 мин.
7. Вымойте клетки дважды и приостановить в 0,1% BSA DPBS + на 10 ⁶ клеток / мл в 0,1% BSA DPBS +.

4. Подготовка реактивной субстрата для параллельных пластин проточной камеры адгезии Пробирной

1. Соединение двух отдельных отрезков трубы с входным и выходным портами камеры параллельного потока пластина, которая соответствует внутри 35 мм блюдо культуры ткани. Один труба соединяется с резервуаром меченых клеток, суспендированных в 0,1% BSA DPBS +, а другой шприцевой насос, который будет удалени жидкости с заданной скоростью потока.
2. Подключите вакуумную линию к проточной камеры ^1.
3. Расположите проточную камеру над 35 мм культуры ткани диш содержащие монослой клеток яичника китайского хомячка, выразив E-селектин (СНО-E). CHO-E клетки выращивали в полной среде MEM при 37 ° С и 5,0% CO _{² 2.}
4. Отрегулируйте проточную камеру и / или проточной камеры прокладку для обеспечения адекватного вакуумное уплотнение ^1.
5. Вывод жидкости из резервуара, мониторинг проточной камеры в сборе для надлежащего уплотнения и без визуального доказательства формирования пузырьков воздуха ^1.
6. Наведите камеру сборку потока на микроскопе (Leica DMI 6000B) ^1.

5. Двухцветный Приобретение изображения

1. Мощность Leica EL-6000 источник компактный свет, или аналогичное устройство, генерировать света высокой интенсивности и пару его в световод. Используйте инвертированного микроскопа, чтобы пройти этот свет через комбинированный фильтр куба, то есть G / R (зеленый / красный) фильтр куба, чтобы возбудить флуорофоры желательного цвета / интенсивности.
2. Убедитесь дихроичное жилья находится в правильном рабочем положении (депрессии) ине находится в режиме байпаса.
3. Эксплуатация микроскопа в режиме флуоресценции и выберите правильный куб флуоресценции фильтра (зеленый / красный).
4. Определить время экспозиции и усиления в камеры 1 (красный; 620 ± 60 нм) и камера 2 (зеленый; 535 ± 40 нм).
   1. Нажмите Дихроичное для получения изображения как в красных и зеленых каналов выбросов. Используйте камеру поток анализа с клетками, меченных только красной флуорофором, и получить изображение в красном канале, регулируя время экспозиции камеры 1 в "живых настройки" программного обеспечения визуализации.
   2. Подходим время экспозиции камеры 2 к времени экспозиции камеры 1. Если изображение наблюдается в зеленом канале, проступание артефакты присутствуют и время экспозиции в обеих камер необходимо уменьшить.
   3. Ведение время экспозиции эквивалент в камеру 1 и камеры 2, не уменьшить время экспозиции до проступание артефакт больше не видно в зеленом канале. Отрегулируйте усиление камеры 1 для улучшения изображения visibilitу в красном канале в случае необходимости.
   4. Повторите шаги 5.4.1 - 5.4.3 с клетками, меченных только зеленой флуорофором, но определить время экспозиции с камерой 2 для изображения клеток в зеленом канале без проступание артефактов в красном канале, собранной камеры 1.
   5. Retitrate антитела, если проступание артефакты не могут быть устранены ^11, или если время экспозиции из камеры 1 и камеры 2 существенно отличаются, так что объединены изображения могут быть временно смещена.
5. Используйте для обработки изображений для просмотра изображений одновременно захваченных из двух монохромный ПЗС-камер в эксперименте камеры поток.
6. Слияние изображений собранных с обеих камер, использующих модуль SimulPix из Streampix 5 или альтернативного пакета программного обеспечения.
7. Используйте цифровые коррективы коррекции в SimulPix или альтернативного программного обеспечения для пространственного выравнивания объединенные изображения, если это необходимо. Изображения могут быть исправлены с помощью модуля SimulPix для горизонтальных, вертикальныхи вращательные корректировки.

Результаты

Параллельный Проточная камера пластины сцепления анализ использовали для демонстрации двойную выбросов камера системы расщепления, что одновременно захваченное изображение последовательности в режиме реального времени в двух каналах выбросов (рис. 1). Двойная камера выбро?...

Обсуждение

Двойная камера выбросов система расщепления имеет пространственное, временное, и оптическое разрешение, необходимое для захвата изображений высокого качества в приложениях, где клетки или молекулярный движение быстро. В генерации репрезентативные результаты, параметры в двойной эм?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
BT-20 cells	ATCC	HTB-19
CHO-E cells	Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 monoclonal antibody	BD Biosciences	555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody	BD Biosciences	555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
			[header]
			Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera	Q Imaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera	Q Imaging	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter	Photometrics	DC2
Inverted Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix