عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

Summary

حقن مكروي هو أسلوب شائع يستخدم لتقديم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، أليغنوكليوتيد] morpholino بواسطة العقاقير أو العلاجات الأخرى في البيض والأجنة، وخلايا الأنواع المختلفة.

Abstract

حقن مكروي إلى خلايا الأجنة وهو أسلوب شائع يستخدم لدراسة مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية. في هذه الطريقة يتم تحميل كمية صغيرة من محلول معالجة في إبرة حقن مكروي الذي يستخدم لحقن الخلايا جسديا يجمد الفردية أو الأجنة. على الرغم من الحاجة إلى التدريب الأولي لتنفيذ هذا الإجراء للتسليم الإنتاجية العالية، حقن مكروي يوفر أقصى قدر من الكفاءة والتسليم استنساخه من مجموعة واسعة من حلول معالجة (بما في ذلك مخاليط معقدة من عينات) في الخلايا، والبيض أو الأجنة. وتشمل التطبيقات لإبر دقيقة جدا تسليم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، البروتينات المؤتلف، وزيادة وظيفة، وفقدان وظيفة الكواشف. يتم إضافة صبغة الفلورسنت أو اللونية في حل حقن لتمكين التصور لحظة من التنفيذ الفعال وكذلك أداة للتطبيع موثوق لمبلغ من الحل تسليمها. الطريقة الموصوفة تمكن Microinjection من 100-400 البحر قنفذ ضygotes في غضون 10-15 دقيقة.

Introduction

كفاءة وقابلة للتكرار تقديم العلاج هي واحدة من التحديات المنهجية الرئيسية للباحثين. وقد وضعت عدة طرق لتقديم حلول عابر العلاج في البيض والأجنة، والخلايا. وتشمل هذه الأساليب التثقيب الكهربائي (على أساس توليد المسام عابرة في غشاء باستخدام النبضات الكهربائية قصيرة) ^1،2، lipofection (تسليم من خلال مزيج من الجسيمات الشحمية التي تحتوي على العلاج مع الغشاء) ^1، وعجلت microparticle القصف ¹ (DNA على ميكرون الجسيمات الحجم المعدنية التي تستخدم بعد ذلك لاختراق الخلايا بسرعة عالية)، وتنبيغ (يتم استخدام فيروس كوسيلة إيصال الجينات المحورة). في هذه اللحظة، حقن مكروي هو النهج الوحيد الذي يحمل ميزة تقديم أي حل مع كفاءة 100٪ مع الحد الأدنى من الكواشف. علاوة على ذلك، حل حقنة واحدة يمكن أن تتكون من مزيج معقد من العلاجات. وقد استخدمت هذه التقنية لنجاحmicroinject لاي البيض والأجنة من العديد من الأنواع مثل قنافذ البحر ^3،4، حمار وحشي الأسماك ^{5، 6} الماوس، الضفدع ^{7، 8} والماشية وكذلك الخلايا واحد في زراعة الأنسجة ^9. كما تم إجراء الحقن عن Blastomeres واحد في وقت لاحق من مراحل النمو ^10-12.

وتستند الأساليب الحالية للإبر دقيقة جدا في طريقة ضغط الحقن التي تم وصفها في البداية من قبل Hiramoto ^10، ولكن تم إحراز تقدم كبير نحو تعظيم الاستفادة من هذه العملية. وقد وصفت تقنيات Microinjection ممتازة في أماكن أخرى ^11، وهنا نحن تصف إحدى الطرق المحددة التي يتم استخدامها حاليا لmicroinject قنفذ البحر (Strongylocentrotus purpuratus) البويضات المخصبة حديثا. لأكثر من قرن، كانت قنافذ البحر على قيمة تجريبية نموذج ^15،16. ترتبط قنافذ البحر تطويريا ارتباطا وثيقا الحبليات (بما في ذلك لنا) وتحليلكشفت الجينوم الخاصة التي تحتوي عليها جميع الأسر الجينات الرئيسية مثل ¹⁷ الإنسان. أنها تنتج عدد كبير من الأجنة النامية بشكل متزامن الشفافة التي يمكن التلاعب بها بسهولة. باستخدام قنفذ البحر باعتباره النموذج الحي، وقد ساهم المجتمع قنفذ البحر في فهمنا لعملية الإخصاب ^{18-21، 22-24} خلية العمليات البيولوجية، والشبكات التنظيمية الجينات (GRNs) ^25-28.

حقن مكروي إلى بيضات ملقحة قنفذ البحر يتطلب عدة خطوات. أولا، تحتاج البيض إلى أن يجمد قبل الحقن (موضح أدناه). والمغلفة أطباق حقن مكروي مع بروتامين سلفات (PS)، مما يخلق سطح موجبة الشحنة، التي يمكن أن البيض سالبة الشحنة الالتزام ^3. وdejellied البيض قبل الحضانة في مياه البحر الحمضية (الرقم الهيدروجيني 5.15) لمدة 10 دقيقة، تليها اثنين يغسل في مياه البحر الطبيعية أو مياه البحر الاصطناعي (درجة الحموضة 8.0). والتجديف بعناية البيض dejellied في خط مستقيمفي منتصف الطبق PS المغلفة في وجود 1 ملم 3 aminotriazole (3-AT)، وهو مطلوب لتمنع نشاط ovoperoxidase الذي يفرز من حبيبات القشرية من البيض نتيجة للإخصاب ^29. هذه الخطوة مهمة لمنع تصلب المغلف الإخصاب وتسهيل دخول إبرة حقن مكروي. كبديل ل1 ملم 3-AT، 10 ملم حمض البارامينوبنزويك (PABA) يمكن استخدامها. يتم تحميل الحل في حقن إبرة حقن مكروي باستخدام المتخصصة microloading ماصة غيض وتركيبه على حامل تعلق على مياداة مجهرية وحدة الضغط (الشكل 1). كل إبرة يمكن استخدامها لmicroinject بيضات ملقحة الفردية في تجارب متعددة في أيام منفصلة. حقن مكروي لا يمكن أن يؤديها لمدة 10-15 دقيقة حتى تتصلب بيضات ملقحة. ثم يتم غسلها بيضات ملقحة مع مياه البحر ومثقف في 15 درجة مئوية. عندما تصل الأجنة الفقس الأريمة المرحلة، التي يطلقون الانزيم الذي يساعد على هضم الفقس مكونات فرtilization المغلف ³⁰ والسماح لهم لفصل بطبيعة الحال من الطبق PS المغلفة. إذا لزم الأمر، ويمكن فصل الأجنة برفق من الطبق باستخدام ماصة باستور ماصة الفم أو عن طريق النفخ بلطف مياه البحر على الأجنة. الطريقة الموصوفة تمكن حقن مكروي فعالة وموثوق بها من 100-400 البويضات المخصبة حديثا على طبق واحد، وتوفير وسيلة الإنتاجية العالية لتحليل المصب.

Protocol

1. إعداد بروتامين سلفات (PS) المغلفة أطباق

1. تحضير محلول 1٪ من سلفات بروتامين (PS) وذلك بإضافة 0.5 غرام من PS إلى 50 مل من منزوع الأيونات والماء المقطر (DDH ₂ O) في أنبوب 50 مل المخروطية. يهز جيدا بسرعة عالية على شاكر مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة لضمان حل كامل للPS. يمكن تخزين هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة 3 أشهر على الأقل (تأكد من تذوب تماما مثل هلام راسب قبل كل استعمال) ^3.
2. كم تأخذ من 60 مم × 15 مم البوليسترين أطباق بتري ووضع كل من الأغطية وقيعان على مقاعد البدلاء.
3. صب 1٪ محلول PS في كل طبق (سواء قيعان والأغطية يمكن استخدامها) ما يكفي لتغطية السطح، يترك لمدة 2 دقيقة على الأقل. الحل PS بقايا يمكن إعادة استخدامها مرات عديدة في غضون 3 أشهر عند تخزينها في 4 درجات مئوية.
4. المكان الأطباق PS المعاملة في دورق مملوء بالماء المقطر (DH ₂ O). ترك الدورق تحت تشغيل DH ₂ O على الأقل10 دقيقة.
5. أطباق PS المغلفة يمكن استخدامها على الفور أو الهواء الجاف للتخزين. تغطيتها لمنع تراكم الغبار. ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 شهر ^3.

2. الحصول على قنفذ البحر الأمشاج وشل البيض على طبق PS المغلفة لحقن مكروي

1. قنافذ البحر تفرخ عن طريق هز أو حقن intracoelomic تصل إلى 1 مل من 0.5٪ بوكل للحث على تقلص العضلات الملساء للافراج عن الأمشاج ³ (الشكل 2).
2. إذا كان الحيوان هو من الذكور، كما يتبين من اللون الأبيض الحيوانات المنوية، وجمع الحيوانات المنوية الجافة من على سطح الأرض من حيوان في أنبوب 1.5 مل. ويمكن تخزين الحيوانات المنوية الجافة في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع دون خسائر كبيرة في الوظيفة البيولوجية.
3. إذا كان الحيوان هو الأنثى، كما يتبين من اللون الأصفر بسبب محتوى صفار البيض، وجمع الأمشاج في بغمر gonopores في كوب كامل من الماء البحر. وسوف يتم الافراج عن البيض من gonopores ويستقر بفعل الجاذبية.
4. تحديد البيض من الحطام مثل أشواك حيوان باستخدام 80 ميكرون نايلون شبكة التصفية. يتم تحقيق أفضل النتائج إذا تم استخدام البيض في غضون 5-7 ساعة بعد وضع البيض.
5. Dejelly البيض:
   1. إعداد 100 مل من ماء البحر الحمضية لحوالي 1 مل من البيض. استخدام 0.5 M حمض الستريك لضبط درجة حموضة مياه البحر من 8.0 درجة الحموضة 5،1-5،2 ل. منخفضة للغاية لدرجة الحموضة ستنخفض الإخصاب وسوف عالية جدا من درجة الحموضة لا تسمح البيض لنعلق على لوحات PS المغلفة.
   2. إضافة البيض (وليس أكثر من 1 مل) لمياه البحر الحمضية والسماح للبيض ليستقر على الجليد لمدة 10 دقيقة. بدلا من ذلك، إزالة هلام معطف يمكن أن تيسره يحوم طيف من البيض أثناء فترة العلاج. يمكن للمرء بشكل فعال dejelly S. البيض purpuratus في 3-4 دقيقة بهذه الطريقة.
   3. صب بعناية قبالة مياه البحر الحمضية، إضافة مياه البحر الطازجة وترك البيض يستقر على الجليد مرة أخرى. ويمكن تخزين البيض Dejellied على الجليد لمدة تصل إلى 6 ساعة دون مشاكل الإخصاب

3. الصف البيض

1. 1 إعداد حل M الاسهم من 3 aminotriazole (3-AT، MW = 84.08) عن طريق إذابة 0.84 غرام من 3-AT في 10 مل من DDH ₂ O. يمكن تخزين هذا الحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. إعداد 1 ملم حل عمل 3-AT بإضافة 50 ميكرولتر من الحل 1 M الأسهم إلى 50 مل من ماء البحر prechilled. الحفاظ على الحل على الجليد.
3. إعداد الفم ماصة (الشكل 3) لمعالجة طيف من البيض:
   1. يتم سحبها يدويا من غيض ماصة بال micropipettes الزجاج (100 × 1.09 مم OD). عقد micropipette بكلتا يديه على اللهب المكشوف. كما يبدأ في الذوبان الزجاج، وسحب بعناية نهايات ماصة في اتجاهات متعارضة.
   2. قم بتوصيل أحد سحبت ماصة لأنابيب البلاستيك (ID 1.14 ملم)، وختم ضيق مع parafilm. يجب أن يكون طول الأنبوب حوالي 50-70 سم.
   3. إدراج العقيمة تصفيتها P20 أو P200 تلميح في نهاية العكس أنبوب للأنابيب الزجاج لأن تستخدم قطعة الفم.
   4. مقطع نهاية من micropipette الزجاج مع مقص لضبط القطر من طرف. قطر الأمثل يتجاوز بقليل من القطر من البيض (80 ميكرون).
4. صب 4 مل من 1 ملم 3-AT مياه البحر في كل طبق PS المغلفة (القاع أو غطاء).
5. اتخاذ ماصة الفم، وضعت غيض P20/P200 في الفم وضمان الحصول عليها مع الأسنان. لنضح البيض، ونضح أول كمية صغيرة من مياه البحر. من خلال وجود عمود من السائل قبل تحميل البيض، واحد من السيطرة القصوى على تقنية pipetting لالفم.
6. موقف الطرف micropipette بالقرب من البيض ونضح بلطف في عدة مئات من البيض في ماصة. حصر البيض داخل micropipette الزجاج.
7. dejellied الصف البيض في خط مستقيم على طبق من قبل تهب بلطف لهم للخروج من ماصة الفم أثناء نقل معلومات سرية في خط مستقيم. الصف البيض الحق قبل الحقن، لأنه قد تحدث مشاكل الإخصاب بسبب عrolonged التعرض إلى 3-AT مياه البحر ^3. علاوة على ذلك، يمكن لاصقة الموجبة مثل PS تكون سامة للبيض، وأنه ليس من المستحسن أن تعرض الأجنة لهذه الكواشف لفترات طويلة، وخاصة إذا تم إزالة المغلفات الإخصاب.
8. جعل الصفر على الطبق بالقرب من خط البيض التجديف باستخدام ماصة الزجاج. وهذا الصفر من المهم كسر إبرة الحقن لضبط تدفق الحل حسب الحاجة. بدلا من ذلك، يمكن إجراء الصفر قبل صب مياه البحر 3-AT إلى الطبق.

4. Microinjection من البحر قنفذ بيضات ملقحة

1. تشغيل محطة حقن مكروي. نحن هنا وصف استخدام نظام حقن FemtoJet.
2. سحب الشعيرات الدموية الحقن باستخدام مجتذب الإبرة. ويصور مثال على إبرة جيدة في الشكل 4. ملاحظة: للحصول على حقن الحمض النووي الريبي، ينبغي سابقة التجهيز الشعيرات الدموية حقن لتجنب التلوث RNAase ^31:
   1. وضع الشعيرات الدموية حقن 50 مل المخروطيةأنابيب وإضافة 50 مل من الميثانول تصفيتها / حمض الهيدروكلوريك (9:1). يهز جيدا وتترك طوال الليل لمدة لا تزيد عن 10 ساعة.
   2. تخلصي من الميثانول / حامض الهيدروكلوريك وشطف الشعيرات الدموية 2X مع الميثانول تصفيتها في نفس الأنبوب.
   3. استنزاف الميثانول قدر الإمكان ويجفد الشعيرات الدموية بين عشية وضحاها لضمان إزالة كاملة من الميثانول.
3. جبل بعناية الشعرية إبرة على حامل إبرة التحميل وتحميله مع <0.5 ميكرولتر من محلول العينة باستخدام نصائح microloader. تتضمن حلول العينة عادة 20٪ الجلسرين، اعتمادا على المواد حقن ^3.
4. وضع طبق البيض مع التجديف على المسرح المجهر (البيض يجب أن تكون محاذاة عموديا عندما ينظر اليها من خلال العدسات) والتركيز على البيض.
5. جبل بعناية الإبرة تحميلها على حامل microinjecting الإبرة وضبط الموقف من الإبرة لقمة مركزة تماما في وسط الميدان.
6. الضغط على الزر لتطبيق الحد الأقصى للضغط FOص تنظيف الإبرة. الحل يجب أن يخرج من إبرة. ضبط ضغط إذا لزم الأمر: يجب أن يكون ضغط الحقن في نطاق 90-360 HPA، مع ضغط التعويض في ما يقرب من 1/3 من ضغط الحقن.
7. ضبط تدفق الحل عن طريق حقن في البويضة غير المخصبة. باستخدام عصا التحكم مياداة مجهرية، وإدارة غيض من إبرة الحقن إلى بيضة غير مخصبة. لتسهيل دخول الإبرة، وإنشاء يرتجف طفيف بواسطة التنصت لطيف من المرحلة مع كائن من الصعب مثل سائق المسمار. وينبغي أن ينظر إلى بلعة حقن تشكيل داخل البويضة (الشكل 5).
8. إذا كان بلعة حقن غير مرئية، ورفع قليلا من رأس الإبرة فوق البيض، وتحديد موقع الصفر على طبق وتعديله ليكون وضع في وسط الميدان. بلطف اضغط على طرف الإبرة إلى علامة الصفر لكسر غيض من إبرة الحقن. ضبط الضغوط حقن والتعويض لضمان أن بلعة حقن لا يتجاوز 5/1 رانه القطر من البيض (1-2 مساء).
9. مرة واحدة يتم معايرة بلعة حقن، يخصب البيض بإضافة الحيوانات المنوية المخفف (1:1،000) أو 1-2 ميكرولتر من الحيوانات المنوية. تخلط جيدا بعناية لمنع طرد صف من البيض.
10. تبدأ مباشرة بعد الحقن يصبح المغلف الإخصاب مرئية (الشكل 5). التحرك على طول خط البيض التجديف باستخدام وحدة تحكم المرحلة وحقن العديد من بيضات ملقحة ممكن عن طريق بدس لهم الإبرة التي يسيطر عليها عصا التحكم مياداة مجهرية.
11. بعد 10-15 دقيقة، فإن البويضات المخصبة حديثا تصبح تصلب ولا يمكن حقن أي لفترة أطول. إزالة الطبق من مرحلة ونضح بعناية من الحيوانات المنوية في مياه البحر 3-AT باستخدام البلاستيك ماصة باستير.
12. لا تدع بيضات ملقحة الجافة. بسرعة إضافة مياه البحر prechilled جديدة لتغطية الطبق. احتضان الأجنة في 15 درجة مئوية.

النتائج

كانت GFP mCherry ويبني مراسل في المختبر كتب وmicroinjected في البويضات المخصبة حديثا. وحضنت الأجنة عند 15 درجة مئوية لمدة 24 ساعة (حتى المرحلة الأريمة) وتصويرها باستخدام مجهر زايس المراقب Z1. لم حقن يبني مراسل لن يؤدي إلى أية عيوب التنموية (الشكل 6). لالكمي للإشارات الف?...

Discussion

حقن مكروي هي تقنية قوية لتقديم علاجات مختلفة مثل الحمض النووي، ومرنا، والبروتينات المؤتلف، وفقدان وظيفة وربح من الكواشف وظيفة، والأصباغ ومجموعاتها في البيض والأجنة، وخلايا الكائنات الحية المختلفة ^1-7. ومع ذلك، يجب أن تبقى العديد من الاعتبارات في الحسبان عند ت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope  Axiovert 40 °C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical  needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles