À haut débit microinjections oursins zygotes

Résumé

La micro-injection est une technique couramment utilisée pour fournir des constructions d'ADN, ARNm, des oligonucléotides morpholino antisens ou d'autres traitements dans les œufs, les embryons et les cellules de diverses espèces.

Résumé

La micro-injection dans des cellules et des embryons est une technique couramment utilisée pour étudier un grand nombre de processus biologiques. Dans ce procédé, une petite quantité de solution de traitement est chargée dans une aiguille de micro-injection qui est utilisée pour injecter physiquement les cellules immobilisées ou des embryons individuels. Malgré la nécessité d'une formation initiale pour effectuer cette procédure pour la livraison à haut débit, la micro-injection offre un maximum d'efficacité et de livraison reproductible d'une grande variété de solutions de traitement (y compris les mélanges complexes d'échantillons) dans les cellules, les ovules ou d'embryons. Applications aux micro-injections comprennent la livraison de constructions d'ADN, ARNm, protéines recombinantes, gain de fonction, et la perte de réactifs de fonction. Colorant fluorescent ou colorimétrique est ajouté à la solution injectée pour permettre la visualisation instantanée de la livraison efficace, ainsi que d'un outil pour la normalisation fiable de la quantité de la solution fournie. La méthode décrite permet la micro-injection de 100-400 oursin zygotes dans 10-15 min.

Introduction

L'administration du traitement efficace et reproductible est l'un des principaux défis méthodologiques pour les chercheurs. Plusieurs méthodes ont été mis en place pour fournir des solutions de traitement transitoire dans les oeufs, embryons et les cellules. Ces procédés comprennent l'électroporation (basé sur une génération de pores transitoires de la membrane à l'aide de courtes impulsions électriques) ^1,2, la lipofection (livraison par la fusion de liposomes contenant au traitement avec la membrane) ^{1, 1} bombardement de microparticules (ADN est précipité sur le micron particules de taille métalliques qui sont ensuite utilisés pour pénétrer dans les cellules à grande vitesse), et la transduction (virus est utilisé en tant que véhicule de délivrance de transgènes). Pour le moment, la micro-injection est la seule approche qui détient l'avantage de délivrer une solution avec 100% d'efficacité avec des réactifs minimes. En outre, une solution d'injection unique peut être composée d'un mélange complexe de traitements. Cette technique a été utilisée avec succès pourment micro-injection des ovules et des embryons de nombreuses espèces tels que les oursins ^3,4, poisson zèbre ^{5, 6} souris, grenouille ^{7, 8} et bovins ainsi que des cellules individuelles dans la culture de tissus ^9. Blastomères simples injections à des stades de développement ultérieurs ont également été menées ^10-12.

Les méthodes actuelles de micro-injections sont basés sur la méthode injection sous pression qui a été initialement décrit par Hiramoto ^10, mais de grands progrès ont été accomplis en vue de l'optimisation de ce processus. D'excellentes techniques de micro-injection ont été décrites ailleurs ^11, et ici nous décrire l'une des méthodes spécifiques qui sont actuellement utilisés pour micro-injection oursin (Strongylocentrotus purpuratus) des oeufs fécondés récemment. Depuis plus d'un siècle, les oursins ont été un précieux modèle expérimental ^15,16. Les oursins sont étroitement liées à l'évolution, les chordés (nous y compris) et l'analyse deleur génome a révélé qu'ils contiennent toutes les grandes familles de gènes que l'homme ^17. Ils produisent un grand nombre de pays en synchrone embryons transparents qui peuvent être facilement manipulées. Utilisation de l'oursin comme un organisme modèle, la communauté de l'oursin a contribué à notre compréhension du processus de la fécondation ^18-21, les processus biologiques cellulaires ^22-24, et les réseaux de régulation génétique (GRNS) ^25-28.

Microinjection dans des zygotes d'oursins nécessite plusieurs étapes. Tout d'abord, les œufs doivent être immobilisées avant les injections (décrit ci-dessous). plats de microinjection sont revêtues avec de la protamine sulfate (PS), qui crée une surface chargée positivement à laquelle les oeufs chargés négativement peuvent adhérer ^3. Les oeufs sont dejellied par incubation dans l'eau de mer acide (pH 5,15) pendant 10 min, suivie par deux lavages dans l'eau de mer naturelle ou de l'eau de mer artificielle (pH 8,0). Les œufs sont soigneusement dejellied ramé en ligne droiteau milieu du plat revêtu PS en présence de 1 mM de 3-aminotriazole (3-AT), qui est nécessaire pour inhiber l'activité de ovoperoxidase qui est sécrétée à partir des granules corticaux de l'œuf à la suite de la fécondation ^29. Cette étape est importante pour empêcher le durcissement de l'enveloppe de la fécondation et de faciliter la pénétration de l'aiguille de micro-injection. Comme alternative à 1 mM 3-AT, 10 mM d'acide paraminobenzoic (PABA) peut être utilisé. La solution d'injection est chargé dans une aiguille de micro-injection en utilisant spécialisé microloading pointe de pipette et monté sur un support fixé au micromanipulateur et de l'unité de pression (figure 1). Chaque aiguille peut être utilisé pour micro-injection zygotes individuels dans de multiples expériences à des jours différents. La micro-injection peut être effectuée pendant 10-15 min jusqu'à ce que les zygotes durcissent. Les zygotes sont ensuite lavées avec de l'eau de mer et on cultive à 15 ° C. Lorsque les embryons atteignent l'éclosion blastula stade, ils libèrent une enzyme qui digère l'éclosion composantes du fertilization enveloppe ³⁰ et leur permettent de se détacher naturellement de la PS plat revêtu. Si nécessaire, les embryons peuvent être doucement détachées de la boîte à l'aide d'une pipette de bouche ou une pipette Pasteur en soufflant doucement de l'eau de mer sur les embryons. La méthode décrite permet la micro-injection efficace et fiable de 100-400 oeufs fécondés récemment sur un plat unique, fournissant une méthode à haut débit pour les analyses en aval.

Protocole

Une. Préparation de Sulfate de protamine (PS) Plats couché

1. Préparer une solution à 1% de sulfate de protamine (PS) en ajoutant 0,5 g de PS à 50 ml d'eau désionisée, de l'eau distillée (FD ₂ O) dans un tube conique de 50 ml. Bien agiter à grande vitesse sur un agitateur de banc à la température ambiante pendant 1-2 heures pour assurer la dissolution complète de PS. Cette solution peut être conservé à 4 ° C pendant au moins 3 mois (assurez-vous de dissoudre complètement précipité de gel avant chaque utilisation) ^3.
2. Prenez une douille de 60 mm x 15 mm de polystyrène boîtes de Pétri et exposer les deux couvercles et les fonds sur le banc.
3. Verser la solution de PS 1% dans chaque plat (deux fonds et les couvercles peuvent être utilisés) juste assez pour couvrir la surface, laisser reposer au moins 2 min. La solution de PS de restes peut être réutilisé de nombreuses fois dans les 3 mois lorsqu'elle est stockée à 4 ° C.
4. Lieu plats PS-traitée dans un bécher rempli d'eau distillée (dH ₂ O). Laisser le bécher sous courant dH ₂ O pendant au moins10 min.
5. PS-plats revêtus peuvent être utilisés immédiatement ou de l'air sec pendant le stockage. Couvrez-les pour éviter l'accumulation de poussière. Ils peuvent être stockés à température ambiante pendant 1 mois ^3.

2. Obtenir oursins gamètes et immobiliser les oeufs sur un plat PS revêtu pour microinjection

1. Spawn oursins en secouant ou injection intracoelomique jusqu'à 1 ml de 0,5% de KCl pour induire la contraction des muscles lisses de libérer des gamètes ³ ​​(figure 2).
2. Si l'animal est un mâle, comme indiqué par la couleur blanche des spermatozoïdes, les spermatozoïdes recueillir sec à partir de la surface d'un animal dans un tube de 1,5 ml. Spermatozoïdes à sec peut être stocké à 4 ° C pendant une semaine sans perte sensible de la fonction biologique.
3. Si l'animal est une femelle, comme indiqué par la couleur jaune due à la teneur en jaune d'œuf, de recueillir ses gamètes en immergeant les gonopores dans un bol rempli d'eau de mer. Les oeufs seront libérés de gonopores et s'installent par gravité.
4. Filtrer les oeufs de débris tels que des épines des animaux à l'aide de 80 um Nylon filtre maille. Les meilleurs résultats sont obtenus si les oeufs sont utilisés dans 5-7 heures après la ponte.
5. Dejelly les œufs:
   1. Préparer 100 ml d'eau de mer acide pendant environ 1 ml d'oeuf. Utiliser 0,5 M d'acide citrique pour ajuster le pH de l'eau de mer à partir de pH 8.0 à 5.1 à 5.2. Trop faible d'un pH diminuera la fécondation et trop élevé d'un pH ne permettra pas d'œufs pour fixer les plaques revêtues PS.
   2. Ajouter les œufs (pas plus de 1 ml) de l'eau de mer acide et permettre aux oeufs de s'installer sur la glace pendant 10 min. En variante, le retrait de la couche de gelée peut être facilitée par tourbillonnement doux des oeufs au cours du traitement. On peut effectivement dejelly œufs de S. purpuratus à 3-4 min de cette façon.
   3. Versez délicatement l'eau de mer acide, ajouter de l'eau de mer frais et laissez les œufs se fixent sur la glace à nouveau. Oeufs Dejellied peuvent être stockés sur de la glace jusqu'à 6 heures sans problèmes de fertilisation

3. Row the Eggs

1. Préparer une solution mère de M 3-aminotriazole (3-AT, MW = 84.08) par dissolution de 0,84 g de 3-AT dans 10 ml de ddH ₂ O. Cette solution peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
2. Préparer la solution 1 mM de travail de 3-AT en ajoutant 50 pi de 1 M solution stock à 50 ml d'eau de mer préalablement refroidi. Conserver la solution sur de la glace.
3. Préparer bouche pipette (figure 3) pour une manipulation en douceur des œufs:
   1. pointe de la pipette est tirée manuellement de micropipettes de verre (100 x OD 1.09 mm). Maintenez la micropipette avec les deux mains sur la flamme. Comme le verre commence à fondre, retirez-le délicatement les extrémités de la pipette dans des directions opposées.
   2. Branchez une pipette tiré à un tube en plastique (ID 1,14 mm), étanchéité avec Parafilm. La longueur du tube doit être d'environ 50 à 70 cm.
   3. Insérer une extrémité P20 ou P200 filtré stérile à l'extrémité du tube opposée au tube de verre deutiliser en tant que pièce d'embouchure.
   4. Clip de la fin de la micropipette de verre avec des ciseaux pour ajuster le diamètre de la pointe. Le diamètre optimal légèrement supérieur au diamètre de l'oeuf (80 um).
4. Verser 4 ml d'mM 3-AT eau de mer 1 dans chaque boîte PS-couché (fond ou le couvercle).
5. Prenez la pipette bouche, mettre la pointe de P20/P200 dans la bouche et le fixer avec les dents. Pour aspirer des oeufs, aspirer d'abord une petite quantité de l'eau de mer. En ayant une colonne de liquide avant le chargement des oeufs, on aura un contrôle maximal sur la technique de pipetage à la bouche.
6. Placez la pointe de la micropipette près des œufs et aspirer doucement dans plusieurs centaines d'oeufs dans la pipette. Confiner les oeufs dans la micropipette de verre.
7. Ligne dejellied oeufs dans une ligne droite sur un plat en les soufflant doucement de la bouche pipette tout en déplaçant la pointe en ligne droite. Ramer les oeufs juste avant les injections, parce que les problèmes de fertilisation peuvent se produire en raison de prolonged exposition au 3-AT eau de mer ^3. En outre, les adhésifs cationiques comme PS peuvent être toxiques pour les œufs, et il n'est pas conseillé d'exposer les embryons de ces réactifs pendant de longues périodes, en particulier si les enveloppes de fertilisation ont été supprimés.
8. Faire une rayure sur le plat près de la ligne d'oeufs ramé aide d'une pipette de verre. Ce zéro sera important de casser l'aiguille d'injection pour régler le débit de la solution en fonction des besoins. Alternativement, le zéro peut être faite avant de verser 3-AT eau de mer à l'assiette.

4. Microinjection des oursins zygotes

1. Tournez sur la station de micro-injection. Nous décrivons ici l'utilisation d'FemtoJet système d'injection.
2. Tirez capillaires d'injection à l'aide d'un extracteur d'aiguilles. Un exemple d'une bonne aiguille est représentée à la figure 4. Remarque: Pour les injections d'ARN, les capillaires d'injection doivent être pré-traitées pour éviter la contamination RNAse ^31:
   1. Placez capillaires d'injection dans 50 ml coniquetubes et ajouter 50 ml de méthanol filtré / HCl (9:1). Secouez bien et laisser toute la nuit pour plus de 10 h.
   2. Verser le mélange méthanol / HCl et rincer les capillaires 2x avec du méthanol filtré dans le même tube.
   3. Drainer le methanol, autant que possible, et lyophiliser les capillaires pendant une nuit pour assurer une élimination complète du methanol.
3. Monter avec précaution le capillaire de l'aiguille sur un support de chargement d'aiguille et le charger avec <0,5 pi d'une solution de l'échantillon à l'aide de conseils microloader. Exemples de solutions contiennent habituellement 20% de glycerol, en fonction de la matière injectée ^3.
4. Placer le plat avec des oeufs ramé sur la platine du microscope (œufs doivent être alignés verticalement, observé à travers les oculaires) et se concentrer sur les oeufs.
5. Enfoncer délicatement l'aiguille chargée sur le porte aiguille de micro-injection et régler la position de l'aiguille pour avoir une pointe parfaitement ciblé dans le milieu du terrain.
6. Appuyez sur le bouton pour appliquer la pression maximale for de nettoyage de l'aiguille. La solution doit venir de l'aiguille. Ajuster la pression si nécessaire: la pression d'injection doit être dans la gamme de 90 à 360 hPa, avec la pression de compensation à environ 1/3 de la pression d'injection.
7. Régler le débit de la solution par injection dans l'œuf non fécondé. L'utilisation d'un micromanipulateur de joystick, diriger la pointe de l'aiguille d'injection à l'œuf non fécondé. Pour faciliter l'entrée de l'aiguille, créer un léger tremblement en tapotant doucement de la scène avec un objet dur comme un tournevis. Un bolus d'injection formant à l'intérieur de l'œuf devrait être considéré (Figure 5).
8. Si le bolus d'injection n'est pas visible, relever légèrement la pointe de l'aiguille au-dessus des oeufs, de localiser le scratch sur le plat et l'ajuster à être positionné au milieu du champ. Tapoter doucement la pointe de l'aiguille de la marque de zéro pour briser la pointe de l'aiguille d'injection. Ajuster les pressions d'injection et de compensation pour faire en sorte que le bolus d'injection ne dépasse pas 1/5 de til diamètre de l'œuf (1-2 heures).
9. Une fois le bolus d'injection est calibré, féconder les œufs en ajoutant le sperme dilué (1:1000) ou 1-2 pi de sperme. Bien mélanger avec soin pour éviter de déloger la rangée d'oeufs.
10. Commencer immédiatement après l'injection de l'enveloppe de la fécondation devient visible (Figure 5). Avancez le long de la ligne d'oeufs ramé en utilisant le contrôleur de scène et injecter autant de zygotes que possible par les piquer avec l'aiguille commandé par joystick micromanipulateur.
11. Après 10-15 minutes, les œufs fécondés nouvellement deviendront trempé et ne peuvent pas être injecté plus longtemps. Retirer le plat du stade et soigneusement aspirer à sperme en 3-AT eau de mer en utilisant une pipette Pasteur en plastique.
12. Ne laissez pas les zygotes sec. Ajouter rapidement de l'eau douce de la mer préalablement refroidi pour couvrir le plat. Incuber les embryons à 15 ° C.

Résultats

GFP et mCherry constructions rapporteurs ont été transcrits in vitro et micro-injecté dans les œufs nouvellement fécondés. Les embryons ont été incubées à 15 ° C pendant 24 heures (jusqu'à ce que le stade blastula) et imagées par Zeiss Observateur Z1 microscope. Injection de constructions rapporteurs n'a pas conduit à des défauts de développement (figure 6). Pour la quantification de signaux de fluorescence, l'acquisition des images a été effectuée à un faible gr...

Discussion

La micro-injection est une technique puissante pour délivrer divers traitements tels que l'ADN, l'ARNm, des protéines recombinantes, une perte de fonction et de gain de fonction de réactifs, les colorants et leurs combinaisons dans des œufs, des embryons et des cellules de divers organismes ^7.1. Toutefois, plusieurs considérations doivent être gardées à l'esprit lors de la conception d'une expérience de micro-injection.

Il est extrêmement important de pre...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope  Axiovert 40 °C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical  needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles