High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Resumo

A microinjecção é uma técnica comum usada para fornecer estruturas de ADN, ARNm, oligonucleidos morfolino anti-sentido ou outros tratamentos em ovos, embriões, e as células de várias espécies.

Resumo

Microinjecção de células e de embriões é uma técnica comum que é usado para o estudo de uma ampla gama de processos biológicos. Neste método, uma pequena quantidade de solução de tratamento é colocado numa agulha de microinjecção que é utilizado para injectar células imobilizadas fisicamente ou embriões individuais. Apesar da necessidade de formação inicial para realizar esse procedimento para entrega de alto rendimento, a microinjeção oferece o máximo de eficiência e entrega reprodutível de uma ampla variedade de soluções de tratamento (incluindo misturas complexas de amostras) em células, ovos ou embriões. Aplicações para microinjeções incluem entrega de construções de DNA, mRNAs, proteínas recombinantes, ganho de função e perda de reagentes de função. Corante fluorescente ou colorimétrica é adicionado à solução injectada para permitir a visualização instantânea de entrega eficiente, bem como uma ferramenta para a normalização fiável da quantidade de solução apresentadas. O método descrito permite microinjeção de 100-400 mar ouriço-do-zygotes dentro de 10-15 minutos.

Introdução

Entrega eficiente e reprodutível tratamento é um dos principais desafios metodológicos para os investigadores. Vários métodos têm sido estabelecidos para entregar transitoriamente soluções de tratamento para os ovos, embriões e células. Estes métodos incluem electroporação (com base em um gerando poros transientes na membrana utilizando impulsos eléctricos curtos) ^1,2, lipofecção (entrega através da fusão de lipossomas contendo de tratamento com a membrana) ^1, bombardeamento com micropartículas ¹ (ADN é precipitado na mícron partículas de dimensão de metal que são, então, utilizadas para penetrar as células a alta velocidade), e transdução (vírus é utilizado como um veículo de entrega de transgenes). No momento, a microinjecção é a única abordagem que tem a vantagem de fornecer uma solução com uma eficiência de 100%, com o mínimo de reagentes. Além disso, uma única solução para injecção pode ser composto por um complexo coquetel de tratamentos. Esta técnica tem sido utilizada para o sucessoly microinject os ovos e embriões de várias espécies, como ouriços do mar, ^3,4 zebra peixe ^{5, 6} rato, sapo ⁷ e ^{8 de} gado, bem como as células individuais na cultura de tecidos ^9. Blastômeros Solteiro injeções em fases posteriores de desenvolvimento também foram realizados ^10-12.

Os métodos atuais de microinjeções são baseados no método de pressão de injeção, que foi inicialmente descrita por Hiramoto ^10, no entanto, grandes progressos foram feitos no sentido de otimização deste processo. Técnicas de microinjeção Excelentes foram descritos em outro ^11, e aqui nós descrevemos um dos métodos específicos que atualmente é usado para microinject ouriço do mar (Strongylocentrotus purpuratus) ovos recém-fertilizados. Por mais de um século, ouriços do mar têm sido um valioso modelo experimental ^15,16. Ouriços do mar são evolutivamente intimamente relacionado com cordados (incluindo nós) e análise deseu genoma revelou que contêm todas as principais famílias de genes como o ¹⁷ humana. Eles produzem um grande número de embriões em desenvolvimento sincronicamente transparentes que podem ser facilmente manipuladas. Usando ouriço do mar como um organismo modelo, a comunidade ouriço do mar tem contribuído para o nosso entendimento do processo de fertilização ^18-21, processos biológicos celulares ^22-24, e as redes de regulação gênicas (GRNs) ^25-28.

Microinjeção em zigotos ouriço-do-mar requer várias etapas. Em primeiro lugar, os ovos devem ser imobilizada antes das injecções (descrito abaixo). Pratos de micro-injecção são revestidas com sulfato de protamina (PS), que cria uma superfície positivamente carregada a que os ovos carregados negativamente podem aderir ^3. Os ovos são dejellied por incubação em água do mar acidificada (pH 5,15) durante 10 min, seguido por duas lavagens em água do mar natural ou de água do mar artificial (pH 8,0). Os ovos são cuidadosamente dejellied remou em uma linha retano meio do prato de PS-revestido na presença de 1 mM de 3-aminotriazole (3-AT), que é necessária para inibir a actividade da ovoperoxidase, que é segregada a partir dos grânulos corticais do ovo como um resultado de fertilização ^29. Esta etapa é importante para prevenir o endurecimento do invólucro de fertilização e de facilitar a entrada da agulha de microinjecção. Como uma alternativa para 1 mM de 3-AT, 10 mM de ácido paraminobenzoic (PABA) pode ser utilizado. A solução injectável é carregado para uma agulha de microinjecção utilizando ponta microloading pipeta especializado e montado sobre um suporte ligado a micromanipulador e da unidade de pressão (Figura 1). Cada agulha pode ser usado para microinject zigotos individuais em várias experiências em dias separados. Microinjecção pode ser realizada durante 10-15 minutos, até os zigotos endurecer. Os zigotos foram então lavadas com a água do mar e cultivadas a 15 ° C. Quando os embriões atingem incubação blastula fase, eles liberam enzimas incubação que digere componentes da fertilization envelope ³⁰ e permitir-lhes retirar naturalmente a partir do prato de PS-revestido. Se necessário, os embriões podem ser suavemente separado do prato usando uma pipeta de boca ou pipeta Pasteur soprando suavemente por água do mar para os embriões. O método descrito permite a microinjecção eficiente e fiável de 100-400 ovos recentemente fertilizados num prato único, fornecendo um método de alto rendimento para a análise a jusante.

Protocolo

1. Preparação de sulfato de protamina (PS) Pratos revestidos

1. Preparar a solução de 1% de sulfato de protamina (PS) por adição de 0,5 g de PS em 50 ml de água destilada e desionizada _(ddH2O) em um tubo de 50 ml. Agitar bem a alta velocidade num misturador de bancada à temperatura ambiente durante 1-2 horas para garantir a dissolução completa do PS. Esta solução pode ser guardada a 4 ° C durante pelo menos 3 meses (certifique-se dissolver completamente precipitado do tipo gel, antes de cada utilização) ^3.
2. Dê uma manga de 60 mm x 15 mm de poliestireno placas de Petri e colocar para fora as duas tampas e fundos no banco.
3. Despeje solução PS 1% em cada prato (ambos os fundos e as tampas podem ser usados) apenas o suficiente para cobrir a superfície, deixe por pelo menos 2 min. A solução residual PS pode ser reutilizado muitas vezes dentro de 3 meses, quando armazenada a 4 ° C.
4. Local PS-tratados pratos num copo cheio de água destilada _(dH2O). Deixe o copo sob execução dH ₂ O, pelo menos,10 min.
5. Pratos PS-revestidos podem ser utilizados imediatamente ou ar seco para o armazenamento. Cubra-os para evitar o acúmulo de poeira. Eles podem ser armazenados à temperatura ambiente por 1 mês ^3.

2. Obter Sea Urchin Gametas e imobilizar os ovos em um prato PS-revestido para microinjeção

1. Ouriços do mar de Spawn por agitação ou injecção intracoelomática de até 1 ml de 0,5% de KCl para induzir a contracção da musculatura lisa para libertar gâmetas ³ (Figura 2).
2. Se o animal é um macho, como indicado pela cor branca de esperma, recolher seco esperma a partir da superfície de um animal para um tubo de 1,5 ml. Esperma seco pode ser armazenado a 4 ° C durante uma semana sem perda significativa da função biológica.
3. Se o animal é uma fêmea, como indicado pela cor amarela devido ao teor de gema de ovo, recolher os seus gâmetas por imersão dos gonopores num copo cheio de água do mar. Os ovos serão liberados a partir de gonopores e estabelecer-se pela gravidade.
4. Filtrar os ovos de detritos, como espinhos animais usando 80 um filtro de malha de nylon. Os melhores resultados são obtidos se os ovos são utilizados dentro de 5-7 h após a desova.
5. Dejelly os ovos:
   1. Preparar 100 ml de água do mar ácida para cerca de 1 ml de ovo. Use ácido cítrico 0,5 M para ajustar o pH da água do mar a partir de pH 8,0 para 5,1-5,2. Muito baixo de um pH diminuirá fertilização e muito alto de um pH não vai permitir que os ovos para anexar as placas revestidas PS.
   2. Adicione os ovos (não mais do que 1 ml) de água do mar ácida e permitir que os ovos para assentar sobre gelo durante 10 min. Alternativamente, a remoção do revestimento de gelatina pode ser facilitada por agitação suave do que os ovos durante o tratamento. Pode-se efetivamente dejelly ovos de S. purpuratus em 3-4 min desta forma.
   3. Com cuidado, despeje a água do mar ácida, adicione a água fresca do mar e deixar que os ovos se estabelecer no gelo novamente. Ovos Dejellied pode ser armazenado em gelo durante até 6 horas sem problemas de fertilização

3. Linha do Eggs

1. Prepare uma solução de estoque de M 3-aminotriazole (3-AT, PM = 84,08) através da dissolução de 0,84 g de 3-AT, em 10 ml de ddH ₂ O. Esta solução pode ser guardada a 4 ° C durante até 6 meses.
2. Preparar uma solução de trabalho mM de 3-AT por adição de 50 ul de uma solução de estoque M a 50 ml de água do mar previamente arrefecido. Manter a solução em gelo.
3. Prepare pipeta boca (Figura 3) para manuseio suave dos ovos:
   1. Ponteira é puxado manualmente a partir de micropipetas de vidro (100 x 1,09 milímetros OD). Segure a micropipeta com ambas as mãos sobre a chama aberta. Como o vidro começa a derreter, puxar cuidadosamente as pontas da pipeta em direcções opostas.
   2. Conecte uma puxada pipeta a um tubo de plástico (ID 1,14 milímetros), o selo apertado com Parafilm. O comprimento do tubo deve ser de aproximadamente de 50-70 cm.
   3. Insira uma P20 ou P200 ponta filtrada estéril no fim do tubo oposto ao tubo de vidro deser utilizado como parte de boca.
   4. Clipe da ponta da micropipeta de vidro com uma tesoura para ajustar o diâmetro da ponta. O diâmetro óptimo excede ligeiramente o diâmetro do ovo (80 mM).
4. Despeje 4 ml de 1 mM de 3-AT água do mar em cada prato PS-revestido (em baixo ou tampa).
5. Tome a pipeta boca, coloque a ponta P20/P200 na boca e prenda-o com os dentes. Para aspirar ovos, primeiro aspirar uma pequena quantidade de água do mar. Por ter uma coluna de líquido antes de carregar os ovos, uma terá máximo controle sobre a técnica de pipetagem boca.
6. Posicione a ponta da micropipeta perto dos ovos e aspirar suavemente em várias centenas de ovos na pipeta. Confinar os ovos dentro da micropipeta de vidro.
7. Row dejellied ovos em uma linha reta em um prato suavemente soprando-los para fora da pipeta boca enquanto se move a ponta em uma linha reta. Linha dos ovos imediatamente antes das injeções, porque os problemas de fertilização pode ocorrer devido ao prolonged exposição a 3-AT água do mar ^3. Além disso, os adesivos catiónicos como o PS pode ser tóxico para ovos, e que não é aconselhável para expor embriões destes reagentes por longos períodos, especialmente se os envelopes de fertilização ter sido removido.
8. Faça um arranhão no prato perto da linha de ovos remado usando uma pipeta de vidro. Este zero será importante para quebrar a agulha de injecção para ajustar o fluxo de solução, conforme necessário. Alternativamente, o zero pode ser feita antes de derramar 3-AT água do mar para o prato.

4. Microinjeção do Mar Urchin zigotos

1. Ligue estação de microinjeção. Aqui nós descrevemos o uso de sistema de injeção FemtoJet.
2. Puxe capilares injeção usando um extrator de agulha. Um exemplo de um bom agulha está representado na Figura 4. Nota: Para injeções de RNA, os capilares de injeção devem ser pré-tratados para evitar a contaminação RNAase ^31:
   1. Coloque capilares de injeção em 50 ml cônicotubos e adicionar 50 ml de metanol / HCl filtrada (9:1). Agite bem e deixe durante a noite para não mais do que 10 horas.
   2. Decantar o metanol / HCl e enxaguar os capilares 2x com metanol filtrada no mesmo tubo.
   3. Drenar o metanol, tanto quanto possível, e liofilizar de capilares durante a noite para assegurar a remoção completa do metanol.
3. Monte cuidadosamente o capilar agulha em um suporte de agulha carga e carregá-lo com <0,5 mL de uma solução de amostra usando dicas Microloader. As soluções de amostra normalmente contêm 20% de glicerol, de acordo com o material injectado ^3.
4. Coloque o prato com ovos remavam no palco microscópio (ovos devem estar alinhados verticalmente quando visto através oculares) e concentrar-se nos ovos.
5. Cuidadosamente montar a agulha carregada no suporte de agulha microinjecção e ajustar a posição da agulha ter uma ponta perfeitamente centrada no meio do campo.
6. Pressione o botão para aplicar a pressão máxima for limpeza da agulha. Solução deve sair da agulha. Regule a pressão, se necessário: a pressão de injecção deve estar no intervalo de 90-360 hPa, com a pressão de compensação de cerca de 1/3 da pressão de injecção.
7. Ajuste o fluxo da solução através da injeção em óvulo não fertilizado. Usando um micromanipulador joystick, direcionar a ponta da agulha de injeção para o óvulo não fertilizado. Para facilitar a entrada da agulha, criar um ligeiro tremor agitando ligeiramente do palco com um objeto duro, como uma chave de fenda. Uma injecção de bolus formando dentro do ovo deve ser visto (Figura 5).
8. Se o bolo de injecção não é visível, aumentar ligeiramente a ponta da agulha acima dos ovos, localizar a zero no prato e ajustá-lo para ser posicionado no meio do campo. Bata levemente a ponta da agulha para a marca zero para quebrar a ponta da agulha de injeção. Ajustar as pressões de injecção e de compensação para assegurar que o bólus não exceder 1/5 do tele diâmetro do ovo (1-2 horas).
9. Uma vez que a injecção de bolus é calibrado, fertilizar os ovos por adição de esperma diluído (1:1000) ou 1-2 ul de esperma. Misture bem com cuidado para evitar a retirada da linha de ovos.
10. Iniciar injecções imediatamente após a fertilização do envelope torna-se visível (Figura 5). Mover ao longo da linha de ovos remavam usando o controlador de palco e injetar tantos zigotos possível, cutucando-os com a agulha controlado por joystick micromanipulador.
11. Depois de 10-15 minutos, os ovos recentemente fertilizados se tornará endurecido e não pode ser injectado mais. Retire o prato do palco e aspirar cuidadosamente para fora o esperma em 3-AT água do mar usando uma pipeta Pasteur de plástico.
12. Não deixe que os zigotos seco. Adicione rapidamente a água prechilled fresco do mar para cobrir o prato. Incubar os embriões a 15 ° C.

Resultados

GFP e mCherry construções repórter foi transcrito in vitro e microinjectado em ovos recentemente fertilizados. Os embriões foram incubados a 15 ° C durante 24 horas (até a fase de blástula) e fotografada usando Zeiss Observador Z1 microscópio. Injecção de construções repórter não conduziu a quaisquer defeitos do desenvolvimento (Figura 6). Para a quantificação dos sinais fluorescentes, a aquisição de imagem foi realizada a baixa ampliação (100X) para capturar maximamente pix...

Discussão

A microinjecção é uma técnica poderosa para entregar vários tratamentos, tais como o ADN, ARNm, proteínas recombinantes, perda de função e ganho de reagentes funcionais, corantes e as suas combinações em ovos, embriões, e as células de vários organismos ^1-7. No entanto, várias considerações devem ser mantidos em mente ao projetar um experimento de microinjeção.

É criticamente importante considerar a solubilidade do tratamento entregue e o volume de injecção. S...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope  Axiovert 40 °C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical  needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles