High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

Resumen

La microinyección es una técnica común que se utiliza para entregar construcciones de ADN, ARNm, oligonucleótidos antisentido morfolino u otros tratamientos en los huevos, embriones y células de diversas especies.

Resumen

La microinyección en células y embriones es una técnica común que se utiliza para estudiar una amplia gama de procesos biológicos. En este método, una pequeña cantidad de solución de tratamiento se carga en una aguja de microinyección que se utiliza para inyectar físicamente células o embriones individuales inmovilizadas. A pesar de la necesidad de una formación inicial para realizar este procedimiento para la entrega de alto rendimiento, la microinyección ofrece la máxima eficiencia y la entrega reproducible de una amplia variedad de soluciones de tratamiento (incluyendo mezclas complejas de muestras) en las células, los óvulos o embriones. Aplicaciones a las microinyecciones incluyen la entrega de las construcciones de ADN, ARNm, proteínas recombinantes, ganancia de función, y la pérdida de función de los reactivos. Colorante fluorescente o colorimétrico se añade a la solución inyectada para permitir la visualización inmediata de la entrega eficiente, así como una herramienta fiable para la normalización de la cantidad de la solución entregada. El método descrito permite la microinyección de 100-400 erizo de mar zygotes dentro de 10 a 15 min.

Introducción

La aplicación del tratamiento eficiente y reproducible es uno de los principales desafíos metodológicos para los investigadores. Varios métodos han sido establecidos para ofrecer soluciones de tratamiento de forma transitoria en los huevos, embriones y células. Estos métodos incluyen la electroporación (basado en una generación de poros transitorios en la membrana utilizando pulsos eléctricos cortos) ^1,2, lipofección (entrega a través de la fusión de liposomas que contiene el tratamiento con la membrana) ^1, bombardeo de micropartículas ¹ (ADN se precipita en la micrones partículas de tamaño de metal que luego se utilizan para penetrar en las células a alta velocidad), y la transducción (virus se usa como un vehículo de entrega de transgenes). Por el momento, la microinyección es el único enfoque que tiene la ventaja de entregar cualquier solución con una eficiencia del 100% con un mínimo de reactivos. Por otra parte, una solución de inyección única puede estar compuesto de un complejo cóctel de tratamientos. Esta técnica se ha utilizado con éxito paraLY microinject los huevos y embriones a partir de numerosas especies tales como erizos de mar ^3,4, pez cebra ^{5, 6} del ratón, rana ^{7, 8} y ganado así como células individuales en el cultivo de tejido ^9. Blastómeros individuales inyecciones en las etapas de desarrollo posteriores también se han llevado a cabo ^10-12.

Los métodos actuales de microinyecciones se basan en el método de presión de inyección que fue descrito inicialmente por Hiramoto ^10, sin embargo, se ha hecho un gran progreso hacia la optimización de este proceso. Excelentes técnicas de microinyección se han descrito en otra parte ^11, y aquí estamos describir uno de los métodos específicos que se utilizan actualmente para microinyectar erizo de mar (Strongylocentrotus purpuratus) los huevos recién fertilizados. Durante más de un siglo, los erizos de mar han sido un valioso modelo de ^15,16 experimental. Los erizos de mar están estrechamente relacionados evolutivamente a cordados (incluyéndonos a nosotros) y el análisis desu genoma reveló que contienen todas las grandes familias de genes como el ¹⁷ humano. Ellos producen un gran número de desarrollar sincrónicamente embriones transparentes que pueden ser fácilmente manipulados. El uso de erizo de mar como un organismo modelo, la comunidad de erizo de mar ha contribuido a nuestra comprensión del proceso de la fecundación ^18-21, procesos biológicos celulares ^22-24, y las redes reguladoras de genes (GRN) ^25-28.

Microinyección en cigotos de erizo de mar requiere de varios pasos. En primer lugar, los huevos deben ser inmovilizada antes de las inyecciones (descrito a continuación). Platos de microinyección se recubren con sulfato de protamina (PS), que crea una superficie cargada positivamente a la que los huevos cargados negativamente pueden adherirse ^3. Los huevos se dejellied por incubación en agua de mar ácida (pH 5,15) durante 10 min, seguido por dos lavados en agua de mar natural o agua de mar artificial (pH 8,0). Los huevos son cuidadosamente dejellied remaron en línea rectaen el medio del plato recubierto de PS en la presencia de 1 mM de 3-aminotriazol (3-AT), que se requiere para inhibir la actividad de ovoperoxidase que es secretada a partir de los gránulos corticales del huevo como un resultado de la fertilización ^29. Este paso es importante para evitar el endurecimiento de la envolvente de la fertilización y para facilitar la entrada de la aguja de microinyección. Como una alternativa a 1 mM de 3-AT, 10 mM de ácido paraminobenzoic (PABA) se puede utilizar. La solución de inyección se carga en una aguja de microinyección usando la punta de la pipeta especializada microloading y montado sobre un soporte unido a micromanipulador y unidad de presión (Figura 1). Cada aguja se puede utilizar para microinyectar cigotos individuales en múltiples experimentos en días separados. La microinyección se puede realizar durante 10-15 minutos hasta que los cigotos se endurecen. Los cigotos se lavan a continuación con el agua de mar y se cultivaron a 15 ° C. Cuando los embriones alcanzan la eclosión blástula etapa, que la liberación de enzima que digiere la eclosión componentes de la FERdotación tilización ³⁰ y les permiten desprenden naturalmente del plato recubierto-PS. Si es necesario, los embriones se pueden separar suavemente de la cápsula, utilizando una pipeta de boca o pipeta Pasteur soplando suavemente el agua de mar en los embriones. El método descrito permite la microinyección eficiente y fiable de 100-400 huevos recién fertilizados en un solo plato, proporcionar un método de alto rendimiento para el análisis aguas abajo.

Protocolo

1. Preparación de protamina sulfato de (PS) Platos Coated

1. Preparar la solución de 1% de sulfato de protamina (PS) mediante la adición de 0,5 g de PS a 50 ml de agua desionizada, agua destilada _(ddH2O) en un tubo cónico de 50 ml. Agite bien a alta velocidad en un agitador banco a temperatura ambiente durante 1-2 horas para asegurar la disolución completa del PS. Esta solución se puede almacenar a 4 ° C durante al menos 3 meses (asegúrese de que para disolver completamente precipitado similar a un gel antes de cada uso) ^3.
2. Tome una manga de 60 mm x 15 mm de poliestireno placas de Petri y diseñar ambas tapas y fondos en el banco.
3. Vierta solución PS 1% en cada plato (ambos fondos y las tapas se pueden utilizar) lo suficiente como para cubrir la superficie, deje por lo menos durante 2 min. La solución PS sobrante puede ser reutilizado muchas veces dentro de 3 meses cuando se almacena a 4 ° C.
4. Lugar platos PS-tratada en un vaso de precipitados lleno con agua destilada _(dH2O). Deja el vaso bajo el chorro de dH ₂ O durante al menos10 min.
5. Placas revestidas-PS se pueden utilizar inmediatamente o secar al aire durante el almacenamiento. Cubra su alcance para evitar la acumulación de polvo. Pueden ser almacenados a temperatura ambiente durante 1 mes ^3.

2. Obtener Erizo de mar Gametos y Inmovilizar los huevos en un plato recubierto de PS para Microinyección

1. Erizos desovar por agitación o inyección intracoelomic de hasta 1 ml de 0,5% de KCl para inducir la contracción de los músculos lisos para liberar los gametos ³ (Figura 2).
2. Si el animal es un macho, como se indica por el color blanco de esperma, recoger esperma seco de la superficie de un animal en un tubo de 1,5 ml. Esperma seco se puede almacenar a 4 ° C durante una semana sin pérdida significativa de la función biológica.
3. Si el animal es una hembra, tal como se indica por el color amarillo debido al contenido de yema de huevo, recoger sus gametos mediante la inmersión de los gonoporos en un vaso de precipitados lleno de agua de mar. Los huevos serán liberados de gonoporos y se establecen por la gravedad.
4. Filtrar los huevos de desechos como espinas animales utilizando 80 micras de malla de filtro de nylon. Los mejores resultados se obtienen si los huevos se utilizan dentro de 5-7 horas después del desove.
5. Dejelly los huevos:
   1. Preparar 100 ml de agua de mar ácida durante aproximadamente 1 ml de huevo. Utilice el ácido cítrico 0,5 M para ajustar el pH del agua de mar de pH 8,0 a 5.1-5.2. Demasiado baja de un pH disminuirá la fertilización y demasiado alta de un pH no permitirán que los huevos se adhieran a las placas recubiertas PS.
   2. Agregar los huevos (no más de 1 ml) al agua de mar ácida y permita que los huevos se establecen en hielo durante 10 min. Alternativamente, la eliminación de la capa de gelatina puede ser facilitada por agitación suave de los huevos durante el tratamiento. Uno puede efectivamente dejelly huevos de S. purpuratus en 3-4 min de esta manera.
   3. Con cuidado, vierta el agua de mar ácida, añada agua fresca del mar y dejar que los huevos se establecen en el hielo de nuevo. Huevos dejellied pueden ser almacenados en el hielo para un máximo de 6 horas sin problemas de fertilización

3. Fila de los huevos

1. Preparar solución 1 M de stock de 3-aminotriazol (3-AT, PM = 84,08) por disolución de 0,84 g de 3-AT en 10 ml de ddH ₂ O. Esta solución se puede almacenar a 4 ° C durante hasta 6 meses.
2. Preparar la solución de trabajo 1 mM de 3-AT mediante la adición de 50 l de una solución 1 M de valores para 50 ml de agua de mar preenfriado. Guardar la solución en hielo.
3. Preparar la boca de la pipeta (figura 3) para una manipulación suave de los huevos:
   1. Punta de la pipeta se extrae manualmente de micropipetas de vidrio (100 x OD 1.09 mm). Sostenga la micropipeta con las dos manos sobre la llama abierta. Como el cristal comienza a derretirse, tire con cuidado los extremos de la pipeta en direcciones opuestas.
   2. Conecte un tirado de la pipeta a un tubo de plástico (ID 1,14 mm), sello hermético con Parafilm. La longitud del tubo debe ser de aproximadamente 50-70 cm.
   3. Insertar un P20 o P200 punta se filtró estéril en el extremo del tubo opuesto al tubo de vidrio aser utilizado como la pieza de boca.
   4. Sujete el extremo de la micropipeta de vidrio con unas tijeras para ajustar el diámetro de la punta. El diámetro óptimo supera ligeramente el diámetro del huevo (80 micras).
4. Verter 4 ml de 1 mM agua de mar 3-AT en cada plato recubierto-PS (inferior o tapa).
5. Tome la pipeta de la boca, coloque la punta P20/P200 en la boca y seguro que con los dientes. Para aspirar los huevos, primero se aspira una pequeña cantidad de agua de mar. Al tener una columna de líquido antes de cargar los huevos, uno tendrá el máximo control sobre la técnica de pipeteo boca.
6. Coloque la punta de la micropipeta cerca de los huevos y aspire suavemente en varios cientos de huevos en la pipeta. Limite los huevos dentro de la micropipeta de vidrio.
7. Fila dejellied huevos en una línea recta en un plato soplando suavemente fuera de la pipeta de la boca mientras se mueve la punta en línea recta. Fila de los huevos justo antes de las inyecciones, porque pueden producirse problemas de fertilización debido a la prolonged exposición al agua de mar de 3 en ^3. Por otra parte, los adhesivos catiónicos como PS pueden ser tóxicos para los huevos, y no es recomendable para exponer embriones para estos reactivos por periodos largos, especialmente si se han eliminado los sobres de fertilización.
8. Hacer un rasguño en el plato cerca de la línea de huevos rowed utilizando una pipeta de vidrio. Este cero será importante para romper la aguja de inyección para ajustar el flujo de la solución según sea necesario. Alternativamente, el cero se puede hacer antes de verter agua de mar 3-AT al plato.

4. La microinyección de los cigotos Urchin Mar

1. Encienda la estación de microinyección. Aquí se describe el uso de sistema de inyección FemtoJet.
2. Tire de los capilares de inyección usando una aguja extractora. Un ejemplo de un buen aguja se representa en la Figura 4. Nota: Para las inyecciones de ARN, los capilares de inyección deben tratarse previamente para evitar la contaminación RNAase ^31:
   1. Coloca los capilares de inyección en 50 ml cónicotubos y añadir 50 ml de metanol se filtra / HCl (9:1). Agitar bien y dejar toda la noche durante no más de 10 horas.
   2. Retirar el metanol / HCl y enjuague de los capilares 2X con metanol filtrada en el mismo tubo.
   3. Escurrir metanol tanto como sea posible y liofilizar los capilares durante la noche para asegurar la completa eliminación de metanol.
3. Monte con cuidado el capilar aguja en un soporte de aguja de carga y cargarlo con <0,5 l de una solución de la muestra utilizando puntas Microloader. Las soluciones de muestra por lo general contienen 20% de glicerol, dependiendo del material inyectado ^3.
4. Coloque el plato con huevos remado en la platina del microscopio (huevos deben estar alineados verticalmente cuando se ve a través de los oculares) y se centran en los huevos.
5. Montar con cuidado la aguja cargada en el soporte de la microinyección de aguja y ajustar la posición de la aguja para tener una punta perfectamente enfocada en el centro del campo.
6. Oprima el botón para aplicar la máxima presión de for limpieza aguja. Solución debe salir de la aguja. Ajustar la presión si es necesario: presión de inyección debe estar en el rango de 90-360 hPa, con la presión de compensación en aproximadamente 1/3 de la presión de inyección.
7. Ajuste el flujo de la solución mediante la inyección en el óvulo sin fertilizar. El uso de un micromanipulador palanca de mando, dirigir la punta de la aguja de inyección al huevo no fertilizado. Para facilitar la entrada de la aguja, cree un ligero temblor golpeando ligeramente las de la etapa con un objeto duro como un destornillador. Un bolo de inyección que forma el interior del huevo debe ser visto (Figura 5).
8. Si el bolo de inyección no está visible, levante un poco la punta de la aguja por encima de los huevos, localizar el rasguño en el plato y ajustarlo a ser colocado en el centro del campo. Golpee suavemente la punta de la aguja a la marca cero para romper la punta de la aguja de inyección. Ajuste las presiones de inyección y de compensación para asegurar que la inyección en bolo no exceda de 1/5 del tque el diámetro del huevo (1-2 pm).
9. Una vez que el bolo de inyección está calibrado, fertilizar los huevos añadiendo esperma diluido (1:1000) o 1-2 l de esperma. Mezclar bien con cuidado para evitar que se desprenda la fila de los huevos.
10. Comience inyecciones inmediatamente después el sobre fertilización se hace visible (Figura 5). Mover a lo largo de la línea de huevos rowed utilizando el controlador de la etapa e inyectar mayor cantidad de cigotos posible por meter con la aguja controlada por micromanipulador joystick.
11. Después de 10-15 minutos, los huevos recién fertilizados se convertirán endurecido y no pueden ser inyectados por más tiempo. Retire el plato de la etapa y con cuidado aspirar a cabo esperma en el agua de mar 3-AT con pipeta Pasteur de plástico.
12. No deje que los cigotos seco. Añadir rápidamente el agua fresca del mar preenfriado para cubrir el plato. Incubar los embriones a 15 º C.

Resultados

GFP y mCherry construcciones informadoras fueron transcrito in vitro y microinyectado en los huevos recién fertilizados. Los embriones se incuban a 15 ° C durante 24 horas (hasta la etapa de blástula), y utilizando imágenes Zeiss Observador Z1 microscopio. La inyección de construcciones reportero no condujo a ningún defectos de desarrollo (Figura 6). Para la cuantificación de las señales fluorescentes, adquisición de imágenes se realizó a baja magnificación (100X) para capturar al m...

Discusión

La microinyección es una técnica poderosa para la entrega de diversos tratamientos, tales como ADN, ARNm, proteínas recombinantes, pérdida de la función y la ganancia de función de reactivos, colorantes y sus combinaciones en huevos, embriones y células de diversos organismos ^1-7. Sin embargo, varias consideraciones deben ser tenidas en cuenta al diseñar un experimento de microinyección.

Es sumamente importante tener en cuenta la solubilidad del tratamiento administrado y...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope  Axiovert 40 °C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical  needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles