Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Zusammenfassung

Mikroinjektion ist eine übliche Technik zur Herstellung von DNA-Konstrukten, mRNAs, Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden oder anderen Behandlungen in Eier, Embryonen und Zellen verschiedener Spezies liefern.

Zusammenfassung

Mikroinjektion in Zellen und Embryonen ist eine übliche Technik, die verwendet wird, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen zu studieren. Bei diesem Verfahren wird eine kleine Menge der Behandlungslösung in einer Mikroinjektionsnadel, die verwendet werden, um physisch injizieren einzelnen immobilisierten Zellen oder Embryonen geladen. Trotz der Notwendigkeit für die Erstausbildung dieses Verfahren für Hochdurchsatz-Lieferung durchzuführen, bietet die Mikroinjektion maximale Effizienz und reproduzierbare Lieferung einer Vielzahl von Behandlungslösungen (einschließlich komplexe Mischungen von Proben) in die Zellen, Eier oder Embryonen. Anwendungen auf Mikroinjektionen Zustellung von DNA-Konstrukte, mRNAs, rekombinante Proteine, Überfunktion, und der Verlust der Funktion Reagenzien. Leuchtstoff-oder farbmetrischen Farbstoff auf der injizierten Lösung gegeben, um sofortige Visualisierung der effizienten Auslieferung sowie ein Tool für zuverlässige Normalisierung der Menge der gelieferten Lösung zu ermöglichen. Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Mikroinjektion von 100-400 Seeigel zygotes innerhalb von 10-15 min.

Einleitung

Effiziente und reproduzierbare Behandlung Lieferung ist eine der wichtigsten methodischen Herausforderungen für Forscher. Mehrere Verfahren wurden eingerichtet, um vorübergehend liefern Behandlungslösungen in die Eier, Embryos, und Zellen. Diese Verfahren umfassen Elektroporation (basierend auf einer Erzeugungs transiente Poren in der Membran unter Verwendung von kurzen elektrischen Impulse) ^1,2, Lipofektion (Lieferung durch die Fusion der Behandlung enthaltenden Liposomen mit der Membran) ^{1, 1} Mikropartikelbeschuss (DNA wird im Mikrometer präzipitiert großen Metallpartikel werden dann verwendet, um die Zellen mit hoher Geschwindigkeit zu durchdringen) und Transduktion (Viren als Träger zur Freisetzung von Transgenen verwendet werden). Im Moment ist die Mikroinjektion der einzige Ansatz, der den Vorteil hat, keine Lösung mit 100% Effizienz mit minimalem Reagenzien enthält. Darüber hinaus kann eine einzelne Injektion Lösung eines Komplexes Cocktail bestehend aus Behandlungen werden. Diese Technik wurde erfolgreich verwendet worden, umly microinject die Eier und Embryonen aus zahlreichen Arten wie Seeigel ^3,4, Zebrafisch ^{5, 6} Maus, Frosch, ^{7, 8} und Rinder sowie einzelne Zellen in der ^{Gewebekultur-9.} Einzel Blastomeren Injektionen in späteren Entwicklungsstadien wurden auch durchgeführt, ^10-12.

Die aktuellen Methoden der Mikroinjektionen auf der Druckinjektionsverfahren, das ursprünglich von Hiramoto ¹⁰ beschrieben wurde, basiert, aber große Fortschritte zur Optimierung dieses Prozesses hergestellt. Ausgezeichnet Mikroinjektion Techniken wurden an anderer Stelle ¹¹ beschrieben, und hier beschreiben wir eines der spezifischen Methoden, die derzeit verwendet wird, um Seeigel (Strongylocentrotus purpuratus) neu befruchtete Eier microinject. Seit über einem Jahrhundert haben Seeigel ein wertvolles experimentelles Modell ^15,16. Seeigel sind evolutionär eng mit Chor (uns) und die Analyse von verwandtenihr Genom zeigte, dass sie alle wichtigen Genfamilien wie das menschliche ¹⁷ enthalten. Sie produzieren eine große Anzahl von synchron Entwicklung transparenter Embryonen, die leicht manipuliert werden kann. Mit Seeigel als Modellorganismus hat die Seeigel-Community, um unser Verständnis der Befruchtung ^18-21, zellbiologische Prozesse ^22-24, und der Gen-regulatorischen Netzwerken (KNS) ^25-28 beigetragen.

Mikroinjektion in Zygoten Seeigel sind mehrere Schritte erforderlich. Zuerst müssen die Eier vor Injektionen (unten beschrieben) immobilisiert werden. Mikroinjektion Speisen werden mit Protaminsulfat (PS), die eine positiv geladene Oberfläche, auf die die negativ geladenen Eier ³ haften schafft beschichtet. Die Eier werden durch Inkubation in saurem Meerwasser (pH 5,15) für 10 min dejellied, gefolgt von zwei Waschungen in natürlichem Meerwasser oder künstlichem Meerwasser (pH 8,0). Die dejellied Eier werden sorgfältig in einer geraden Linie gerudertin der Mitte der PS-beschichtete Schale in Gegenwart von 1 mM 3-Aminotriazol (3-AT), die erforderlich ist, um die Aktivität von Ovoperoxidase, die aus den kortikalen Granulat des Eies als Folge der Düngung ²⁹ abgesondert wird hemmen. Dieser Schritt ist wichtig, um die Härtung der Befruchtung Hülle zu verhindern und Mikroinjektionsnadel Eingabe zu erleichtern. Als Alternative zu 1 mM 3-AT können 10 mM paraminobenzoic Säure (PABA) verwendet werden. Die Injektionslösung wird in eine Mikroinjektionsnadel, die spezialisierte Microloading Pipettenspitze geladen und auf einem Halter zu Mikromanipulator und Druckeinheit angebracht ist (Fig. 1) montiert. Jede Nadel können einzelne Zygoten in mehreren Versuchen an verschiedenen Tagen microinject werden. Mikroinjektion kann für 10-15 Minuten durchgeführt werden, bis die Zygoten aushärten. Die Zygoten werden dann mit dem Meerwasser und kultiviert bei 15 º C gewaschen Wenn die Embryonen erreichen Brut Blastulastadium, Brut Enzym, das Komponenten des fer verdaut geben sietilization Umschlag ³⁰ und damit sie natürlich aus der PS-beschichtete Schale lösen. Falls erforderlich, können die Embryonen vorsichtig aus der Schüssel mit dem Mund ansaugen oder Pasteurpipette durch sanft weht Meerwasser auf die Embryonen gelöst werden. Das beschriebene Verfahren ermöglicht eine effiziente und zuverlässige Mikroinjektion von 100-400 frisch befruchteten Eier auf einem einzigen Gericht, die eine Hochdurchsatzverfahren für Downstream-Analysen.

Protokoll

1. Herstellung von Protaminsulfat (PS) Beschichtete Geschirr

1. Vorbereitung 1% igen Lösung von Protaminsulfat (PS) durch Zugabe von 0,5 g PS auf 50 ml entionisiertem, destilliertem Wasser (ddH ₂ O) in einem 50 ml konischen Röhrchen. Schütteln bei hoher Geschwindigkeit auf einer Bank Schüttler bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden, um eine vollständige Auflösung von PS zu gewährleisten. Diese Lösung kann bei 4 ° C für mindestens 3 Monate gelagert werden (stellen Sie sicher, gelartige Niederschlag vollständig gelöst vor jedem Gebrauch) ^3.
2. Nehmen Sie eine Hülse von 60 mm x 15 mm Polystyrol-Petrischalen und legen Sie beide Deckel und Böden auf der Bank.
3. Gießen Sie 1% PS-Lösung in jeder Schale (beide Böden und Deckel verwendet werden kann) gerade genug, um die Oberfläche bedecken, lassen Sie mindestens 2 min. Die übrig gebliebenen PS-Lösung können viele Male wiederverwendet werden innerhalb von 3 Monaten bei 4 ° C gelagert werden
4. PS-Platz behandelt Gerichte in einem Becherglas mit destilliertem Wasser (dH ₂ O) gefüllt. Lassen Sie den Becher unter fließendem dH ₂ O für mindestens10 min.
5. PS-beschichteten Platten können sofort oder Luft für Lagerung verwendet werden. Cover sie zu Staubansammlung zu verhindern. Sie kann bei Raumtemperatur 1 Monat ³ gespeichert werden.

2. Erhalten Seeigel Gameten und Unbeweglichkeitseffekt die Eier auf einem PS-beschichteten Teller für Mikroinjektion

1. Spawn Seeigel durch Schütteln oder intracoelomic Injektion von bis zu 1 ml 0,5% KCl zu einer Kontraktion der glatten Muskulatur zu bewegen, Gameten ³ (Abbildung 2) zu lösen.
2. Wenn das Tier eine männliche, wie durch die weiße Farbe Spermien angegeben, sammeln Samentrocken von der Oberfläche eines Tieres in ein 1,5-ml-Röhrchen. Trocken Spermien bei 4 ° C eine Woche ohne wesentlichen Verlust der biologischen Funktion gespeichert werden.
3. Wenn das Tier ein Weibchen, wie die gelbe Farbe aufgrund der Eigelbgehalt angegeben, sammeln seine Gameten durch Eintauchen der gonopores in einem Becher voll von Meerwasser. Die Eier werden von gonopores freigesetzt werden und sich durch die Schwerkraft.
4. Filtern Sie die Eier von Schmutz wie Tier Stacheln mit 80 um Nylon-Mesh-Filter. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Eier innerhalb von 5-7 Stunden nach dem Laichen verwendet.
5. Dejelly die Eier:
   1. Es werden 100 ml saurem Meerwasser für etwa 1 ml Ei. Verwenden Sie 0,5 M Zitronensäure auf pH-Wert des Meerwassers von pH 8,0 bis 5,1 bis 5,2 einzustellen. Ein zu niedriger pH-Wert der Befruchtung zu verringern und zu hohen pH-Wert wird nicht zulassen, Eier, auf die PS-beschichteten Platten zu befestigen.
   2. Die Eier (nicht mehr als 1 ml) zu sauren Meerwasser und lassen Sie die Eier auf Eis für 10 Minuten nieder. Alternativ kann die Entfernung des Gelee Mantel unter leichtem Schwenken der Eier während der Behandlung gefördert werden. Man kann effektiv dejelly S. purpuratus Eier in 3-4 min auf diese Weise.
   3. Vorsichtig abgießen sauren Meerwasser, fügen Sie frisches Meerwasser und lassen Sie die Eier nieder auf Eis wieder. Dejellied Eier auf Eis für bis zu 6 Stunden ohne Befruchtung Probleme gelagert werden

3. Reihe sind die Eier

1. Bereiten 1 M Stammlösung von 3-Aminotriazol (3-AT, MW = 84,08) durch Lösen von 0,84 g 3-AT in 10 ml ddH ₂ O. Diese Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 6 Monate gelagert werden.
2. Bereiten 1 mM Arbeits Lösung von 3-AT durch Zugabe von 50 ul 1 M Stammlösung zu 50 ml vorgekühltes Meerwasser. Die Lösung wird auf Eis.
3. Bereiten Mund Pipette (Abbildung 3) für die schonende Behandlung der Eier:
   1. Pipettenspitze manuell von Glasmikropipetten (100 x 1,09 mm OD) gezogen. Halten Sie die Mikropipette mit beiden Händen über dem offenen Feuer. Als das Glas zu schmelzen beginnt, vorsichtig die Enden der Pipette in entgegengesetzte Richtungen ziehen.
   2. Schließen Sie das eine zog Pipette in ein Kunststoffschlauch (ID 1,14 mm), dicht schliesst mit Parafilm. Die Länge der Rohrleitung sollte ungefähr 50-70 cm.
   3. Legen Sie eine sterilfiltrierte P20 oder P200 Spitze am Ende des Rohres gegenüber dem Glasrohr zuals Mundstück verwendet werden.
   4. Clip der Ende des Glasmikropipette mit einer Schere, um den Durchmesser der Spitze einstellen. Der optimale Durchmesser etwas größer als der Durchmesser des Eies (80 &mgr; m).
4. Gießen 4 ml 1 mM 3-AT Meerwasser in jedem PS-beschichtete Schale (Boden oder Deckel).
5. Nehmen Sie die Pipette Mund, legte das P20/P200 Spitze in den Mund und sichern Sie sie mit den Zähnen. Um Eier zu saugen, saugen zuerst eine kleine Menge von Meerwasser. Durch eine Flüssigkeitssäule vor dem Laden der Eier zu erhalten, muß eine maximale Kontrolle über den Mund Pipettierens.
6. Positionieren Sie den Mikropipettenspitze in der Nähe der Eier und vorsichtig aspirieren in mehrere hundert Eier in der Pipette. Beschränken Sie die Eier in der Glasmikropipette.
7. Row dejellied Eier in einer geraden Linie auf einer Schüssel vorsichtig bläst sie aus dem Mund Pipette während der Bewegung die Spitze in einer geraden Linie. Zeile die Eier direkt vor den Injektionen, weil die Befruchtung Probleme können auftreten, aufgrund prolonged Einwirkung von 3-AT ³ Meerwasser. Außerdem können kationische Klebstoffe wie PS toxisch Eier, und es ist nicht ratsam, Embryonen dieser Reagenzien für längere Zeit ausgesetzt werden, insbesondere wenn die Befruchtung Briefumschläge entfernt wurden.
8. Einen Kratzer auf der Schale in der Nähe der Linie der ruderten Eier mit einer Glaspipette. Diese Kratzer wird wichtig sein, die Injektionsnadel zu brechen, um den Fluss der Lösung nach Bedarf anzupassen. Alternativ kann die Kratz vor dem Gießen 3-AT Meerwasser in die Schale gestellt werden.

4. Mikroinjektion von der Sea Urchin Zygotes

1. Schalten Sie die Mikroinjektion Station. Hier beschreiben wir die Verwendung von FemtoJet Einspritzsystem.
2. Ziehen Injektionskapillaren mit einer Nadel Magnet. Ein Beispiel eines gut Nadel ist in Fig. 4 dargestellt. Hinweis: Für die RNA-Injektionen, sollte Injektionskapillaren vorbehandelt werden, um Kontamination RNAase ³¹ zu vermeiden:
   1. Platzieren Injektionskapillaren in 50 ml konischenRöhrchen und 50 ml der gefilterten Methanol / HCl (9:1). Gut schütteln und über Nacht verlassen, nicht länger als 10 Stunden.
   2. Gießen Sie das Methanol / HCl und spülen die Kapillaren mit 2x gefiltert Methanol in das gleiche Rohr.
   3. Drain Methanol so weit wie möglich zu lyophilisieren und die Kapillaren über Nacht, um eine vollständige Entfernung von Methanol zu gewährleisten.
3. Vorsichtig aufsetzen Nadel Kapillare auf einer Nadel Ladehalter und laden Sie es mit <0,5 ul einer Probenlösung mit Microloader Tipps. Probenlösungen enthalten in der Regel 20% Glycerin, je nach der injizierten Materials ^3.
4. Die Schale mit ruderte Eier auf den Mikroskoptisch (Eier sollte vertikal ausgerichtet, wenn durch die Okulare betrachtet werden) und konzentrieren sich auf die Eier.
5. Vorsichtig aufsetzen geladen Nadel auf den Nadelhalter Mikroinjektion und die Position der Nadel zu einem perfekt fokussierten Spitze in der Mitte des Feldes zu haben.
6. Drücken Sie die Taste, um den maximalen Druck fo geltenr Nadelreinigung. Lösung sollte aus der Nadel zu kommen. Stellen Sie den Druck, falls erforderlich: Einspritzdruck sollte im Bereich von 90 bis 360 hPa, mit der Kompensationsdruck bei etwa 1/3 des Einspritzdrucks.
7. Stellen Sie die Lösungsstrom durch Injektion in unbefruchteten Ei. Mikromanipulator mit einem Joystick, leiten die Spitze der Injektionsnadel auf die unbefruchtete Ei. Um Nadel Eingabe zu erleichtern, erstellen Sie ein leichtes Zittern durch leichtes Ausschlagen der Bühne mit einem harten Gegenstand, zB einem Schraubendreher. Eine Bolus-Injektion in das Ei bilden sollen (Fig. 5) ersichtlich.
8. Wenn die Einspritz Bolus nicht sichtbar ist, etwas erhöhen die Spitze der Nadel über die Eier, suchen Sie die Kratzer auf der Schale und stellen Sie in der Mitte des Feldes positioniert werden. Klopfen Sie leicht die Nadelspitze auf die Kratzspur, um die Spitze der Injektionsnadel zu brechen. Einstellen der Einspritzausgleichsdrücke zu gewährleisten, dass der Bolus Injektion nicht mehr als 1/5 von ter Durchmesser des Eis (1-2 pm).
9. Sobald die Injektion Bolus kalibriert ist, die Eier zu befruchten, indem verdünnt Spermien (1:1000) oder 1-2 ul der Spermien. Gut mischen sorgfältig verdrängen die Reihe der Eier zu verhindern.
10. Start-Injektionen, unmittelbar nachdem die Befruchtung Umschlag sichtbar (Fig. 5) wird. Bewegen Sie sich entlang der Linie der Eier ruderte mit dem Stufenregler und spritzen so viele Zygoten wie möglich durch Stossen sie mit der Nadel durch Mikromanipulator Joystick gesteuert.
11. Nach 10-15 min, werden die neu befruchtete Eier werden gehärtet und kann nicht mehr eingespritzt werden. Entfernen Sie die Schale von der Bühne und sorgfältig absaugen aus Spermien in 3-AT Meerwasser mit einem Kunststoff-Pasteur-Pipette.
12. Lassen Sie nicht die Zygoten trocken. Schnelles Hinzufügen von frischem Meerwasser vorgekühlten, die Schüssel abdecken. Die Embryonen inkubieren bei 15 ° C.

Ergebnisse

GFP und mCherry Reporterkonstrukte wurden in vitro transkribiert und in die neu befruchtete Eier mikroinjiziert. Embryonen wurden bei 15 ° C für 24 h (bis Blastula-Stadium) inkubiert und abgebildet mit Zeiss Observer Z1 Mikroskop. Die Injektion von Reporterkonstrukte zu keinen Entwicklungsdefekten führen (Abbildung 6). Zur Quantifizierung der Fluoreszenzsignale wurde die Bildaufnahme bei geringer Vergrößerung (100X) durchgeführt, um zu erfassen maximal Fluoreszenz Pixel (6D-F).

Diskussion

Mikroinjektion ist eine leistungsfähige Technik für die Bereitstellung von verschiedenen Behandlungen, wie DNA, mRNA, rekombinante Proteine, Funktionsverlust und Überfunktion Reagenzien, Farbstoffe und deren Kombinationen in Eier, Embryonen und Zellen von verschiedenen Organismen, ^1-7. Allerdings sollten einige Überlegungen bei der Gestaltung einer Mikroinjektion Experiment gehalten werden.

Es ist sehr wichtig, um die Löslichkeit des zuge Behandlung und die Einspritzmenge zu ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope  Axiovert 40 °C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical  needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles