성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

요약

미세 주입 계란, 배아, 다양한 종류의 세포로 DNA의 구조, mRNA를, 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 다른 치료를 제공하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다.

초록

세포 및 배아로 마이크로 인젝션은 생물학적 과정의 광범위한 연구하는 데 사용되는 일반적인 기술이다. 이 방법에서는 처리 액의 소량의 개별 물리적 고정화 세포 또는 배아를 주입하는 데 사용되는 마이크로 인젝션 니들에로드된다. 높은 처리량 전달을 위해이 절차를 수행하려면 초기 교육의 필요성에도 불구하고, 미세 주입은 최대의 효율성과 세포, 계란 또는 태아에 (샘플의 복잡한 혼합물을 포함한다) 치료 솔루션의 다양한 재현 배달을 제공합니다. microinjections에 응용 프로그램은 DNA의 구조, mRNA를, 재조합 단백질, 기능의 증가, 기능 시약의 손실 전달 있습니다. 형광 또는 비색 염료 인스턴트 효율적인 전달 시각화뿐만 아니라 전달되는 용액의 양의 신뢰성 정상화하기위한 도구를 사용하는 주입 용액에 첨가된다. 한 방법은 100 ~ 400 성게 Z의 미세 주입을 가능하게10 ~ 15 분 이내 ygotes.

서문

효율적이고 재생 가능한 치료 배달 연구원의 주요 방법론적인 문제 중 하나입니다. 여러 가지 방법이 일시적으로 계란, 배아 세포로 치료 솔루션을 제공하기 위해 설립되었습니다. 이러한 방법은 ^{1, 2,} 리포 펙 (막 치료 함유 리포좀의 융합을 통해 배달) ^1, 미세 충격 ¹ (DNA가 마이크론에 침전 (짧은 전기 펄스를 사용하여 막에서 생성 과도 모공 기준) 일렉트로 포함 크기의 금속 후 고속으로 세포에 침투하는 데 사용되는 입자) 및 전달 (바이러스가 도입 유전자의 전달 수단으로 사용된다.) 이때, 마이크로 인젝션 시약은 최소한 100 %의 효율로 임의의 솔루션을 제공하는 장점을 보유하는 유일한 방법이다. 또한, 단일 주입 용액 처리의 복잡한 칵테일로 구성 될 수있다. 이 방법은 성공적으로 사용되어왔다LY는 성게 ^3,4, 얼룩말 물고기 ^5, 마우스, ^{6, 7,} 개구리, 소 ^8뿐만 아니라 조직 배양 ⁹ 단일 세포와 같은 많은 종에서 계란과 배아를 microinject. 나중에 발달 단계에서 단일 할구 주사는 ^10-12를 실시하고 있습니다.

microinjections의 현재의 방법은 처음 Hiramoto ^10에 의해 설명 된 감압 주입법에 기반하지만, 실력이 프로세스의 최적화를 향해 제되었다. 우수한 미세 주입 기술은 다른 ^11에 설명되어 있고, 여기에 우리가 현재 성게 (Strongylocentrotus의 purpuratus) 새로 수정 된 알을 microinject하는 데 사용되는 특정 방법 중 하나를 설명합니다. 세기 이상, 성게 가치있는 실험 모델 ^{(15, 16)하고있다.} 성게는 진화 적으로 밀접하게 (우리 포함) 척색 동물과 분석에 관련된자신의 게놈은 인간의 ^17과 같은 모든 주요 유전자 가족을 포함하는 것으로 나타났습니다. 그들은 기적으로 쉽게 조작 할 수있는 투명 배아 개발의 다수 생산. 모델 생물로 성게를 사용하여, 성게 사회는 우리의 수정 과정의 이해 ^18-21, 세포 생물학적 과정 ^{22 ~ 24,} 및 유전자 조절 네트워크 (GRNs) ^{25 ~ 28에} 기여하고있다.

성게의 수정란에 미세 주입 몇 가지 단계가 필요합니다. 첫째, 계란은 사전 (아래에 설명) 주사에 고정 될 필요가있다. 미세 주입 요리는 음으로 대전 된 계란 ^3을 준수 할 수있는 양으로 대전 된 표면을 생성 프로타민 황산 (PS)로 코팅되어있다. 계란은 천연 해수 또는 인공 해수 (산도 8.0)의 두 세척 한 다음, 10 분 동안 산성 바닷물에서 배양 (산도 5.15)에 의해 dejellied됩니다. dejellied 계란은 신중하게 직선으로 저어됩니다시비 ^(29)의 결과로 계란의 피질에서 과립 분비 ovoperoxidase의 활성을 억제하는 데 필요한 1 내지 3mm aminotriazole-(3-AT)의 존재하에 PS 코팅 접시의 중앙. 이 단계는 시비 포락선의 경화를 방지하고, 마이크로 인젝션 니들 진입을 용이하게하기 위해 중요하다. 1 mM의 3-AT에 대한 대안으로, 10 mM의 paraminobenzoic 산 (PABA)이 사용될 수있다. 주사액 전문 마이크로 로딩 피펫 팁을 사용하는 마이크로 인젝션 용 바늘에로드 micromanipulator에 압력 부에 부착 된 홀더 (도 1)에 장착된다. 각각의 바늘은 별도의 일에 대한 여러 실험에서 각각의 접합자를 microinject하는 데 사용할 수 있습니다. 접합자가 강화 될 때까지 미세 주입은 15 분 동안 수행 할 수 있습니다. 접합자는 다음 15 ℃에서 바다 물을 배양 세척 배아 blastula 단계 부화에 도달하면, 그들은 그다지의 구성 요소를 소화 부화 효소를 해제tilization 봉투 ^(30)과 그들을 자연스럽게 PS-코팅 접시에서 분리 할 수 있습니다. 필요한 경우, 배아 부드럽게 부드럽게 배아에 해수를 불어 입 피펫 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시로부터 분리 될 수있다. 설명 된 방법은 다운 스트림 분석을위한 높은 처리량을 제공하는 방법, 하나의 접시 100-400 새롭게 수정란의 효율적이고 신뢰성있는 미세 주입을 가능하게한다.

프로토콜

1. 프로타민 황산염의 제조 (PS) 요리를 코팅

1. 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 탈 이온수, 증류수 (DDH ₂ O) 50 ㎖에 PS 0.5 g을 첨가하여 프로타민 설페이트 (PS)의 1 % 용액을 제조 하였다. PS의 완전한 해체를 확인하기 위해 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 벤치 통에 빠른 속도로 잘 흔들어. 이 솔루션은 (완전히 각 사용하기 전에 젤 같은 침전물을 분해해야합니다) ³ 최소한 3 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 60mm X 15mm의 폴리스티렌 페트리 접시의 소매를 가지고 벤치에 모두 뚜껑과 바닥을 배치.
3. 최소 2 분 동안두고, 표면을 커버하기에 충분한 각 접시에 1 %의 PS 솔루션을 (모두 바닥과 뚜껑을 사용할 수 있습니다) 붓는다. 4 ℃에서 저장 될 때 나머지의 PS 솔루션을 3 개월 이내에 여러 번 재사용 할 수 있습니다
4. 장소 증류수 DH ₍₂ O)로 가득 비커에 요리를 PS 처리. 에 dH보다 ₂ O를 실행에서 비커를 남겨 이상10 분.
5. PS-코팅 된 요리는 저장을 위해 즉시 또는 건조한 공기 사용할 수 있습니다. 먼지 축적을 방지하기 위해 그들을 커버. 그들은 1 달 ³ 상온에서 저장할 수 있습니다.

2. 성게 배우자를 얻고 미세 주입을위한 PS-코팅 접시에 계란을 무력화

1. 배우자 ³ (그림 2)를 출시 평활근의 수축을 유도하는 동요 또는 0.5 %의 KCl 최대 1 ㎖의 intracoelomic 주사 알 성게.
2. 동물 수컷이라면, 백색 정자으로 나타낸 바와 같이, 1.5 ㎖의 튜브에 동물의 표면으로부터 정자 건조수록. 드라이 정자는 생물학적 기능의 큰 손실없이 일주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. 동물 인해 노른자 내용으로 노란색으로 표시된 바와 같이 여성, 바다 물이 가득 비커에 gonopores 침지하여 배우자를 수집하는 경우. 계란 gonopores에서 발표 및 중력에 의해 아래로 정착 될 것입니다.
4. 이물질 등 80 μm의 나일론 필터 메쉬를 사용하여 동물의 등뼈로 계란을 필터링합니다. 계란이 산란 후 5-7 시간 내에서 사용하는 경우 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다.
5. 계란을 Dejelly :
   1. 계란의 약 1 ㎖에 산성 바다 물 100 ㎖를 준비합니다. 5.1-5.2 pH가 8.0에서 해수의 pH를 조정하는 0.5 M 구연산을 사용합니다. 산도가 너무 낮은 수정을 감소하고 pH가 너무 높은 계란은 PS 코팅 된 플레이트에 부착 할 수 없습니다.
   2. 산성 바다 물에 계란 (이하 1 ㎖)를 추가하고 계란은 10 분 동안 얼음에 정착 할 수 있습니다. 대안 적으로, 젤리 코트의 제거는 치료 중에 계란의 부드러운 소용돌이에 의해 촉진 될 수있다. 하나는 3 ~ 4 분에서 효과적으로 dejelly이 방법을 S.의 purpuratus 계란을 할 수 있습니다.
   3. 조심스럽게, 산성 바다 물을 부어 신선한 바다 물을 추가하고 계란이 다시 얼음에 정착 할 수 있습니다. Dejellied 계란 수정 문제없이 최대 6 시간 동안 얼음에 저장할 수 있습니다

3. 계란에게 행

1. DDH ₂ O의 10 ㎖에 3-AT의 0.84 g을 용해하여 3 aminotriazole (3-AT, MW = 84.08)의 1 M 주식 솔루션을 준비합니다 이 솔루션은 최대 6 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. prechilled 바다의 물 50 ㎖에 1 M 주식 솔루션의 50 μl를 추가하여 3-AT의 1 ㎜ 작업 솔루션을 준비합니다. 얼음에 솔루션을 보관하십시오.
3. 계란의 부드러운 처리를 위해 입 피펫 (그림 3)를 준비 :
   1. 피펫 팁을 수동으로 유리 마이크로 피펫 (100 × 외경 1.09 mm)에서 당겨진다. 불꽃에 두 손으로 마이크로 피펫을 잡고. 유리가 녹기 시작으로, 조심스럽게 반대 방향으로 피펫의 끝을 당겨.
   2. 하나는 파라 필름으로 단단히 밀봉 플라스틱 튜브 (ID 1.14 mm)에 피펫을 뽑아 연결합니다. 튜브의 길이는 약 50~70센티미터해야한다.
   3. 행 유리관에 튜브의 대향 단부에서 멸균 여과 P20 또는 P200 팁을 삽입마우스 피스로 사용할 수.
   4. 팁의 직경을 조절하기 위해 가위로 유리 마이크로 피펫의 끝을 클립. 최적의 직경은 약간 달걀 (80 μM)의 직경을 초과한다.
4. 각 PS-코팅 접시 (바닥 또는 뚜껑)에 1 mM의 3-AT 바다 물 4 ㎖를 붓는다.
5. 입 피펫을 입에 P20/P200 팁을 넣어 이빨로 고정. 계란 대기음하려면 먼저 해수 소량 대기음. 종래 계란로드에 액체의 열을 구비함으로써, 하나의 입 피펫 팅 기법을 통해 최대 제어 할 것이다.
6. 계란 근처에 마이크로 피펫 팁을 배치하고 부드럽게 피펫에 계란 수백에서 대기음. 유리 마이크로 피펫에서 계란을 제한 할 것.
7. 행 직선의 끝을 이동하는 동안 부드럽게 입 피펫 그들을 불어 접시에 직선으로 계란을 dejellied. 수정 문제로 인해 P 발생할 수 있기 때문에, 바로 주사하기 전에 계란을 행3-AT 바다 물 ^3에 대한 노출을 rolonged. 또한, PS와 같은 양이온 성 접착제는 계란에 독성이있을 수 있고, 수정 봉투가 제거 된 경우에는 특히 오랜 기간 동안 이러한 시약으로 배아를 노출하지 않는 것이 좋습니다.
8. 유리 피펫을 사용하여 저었다 계란의 라인 근처 접시에 스크래치를 확인합니다. 이러한 스크래치는 필요에 따라 용액의 유량을 조정하는 주사 바늘을 중단하는 것이 중요 할 것이다. 또한, 스크래치가 접시에 3-AT 바다 물을 붓는 전에 할 수있다.

4. 성게의 수정란 미세 주입

1. 미세 주입 스테이션의 전원을 켭니다. 여기에서 우리는 FemtoJet 분사 시스템의 사용을 설명한다.
2. 바늘 풀러를 사용하여 주입 모세 혈관을 당깁니다. 좋은 바늘의 일례가도 4에 도시된다. 참고 : RNA 주입은, 주입 모세 혈관 RNAase 오염 ^(31)를 방지하기 위해 전처리되어야한다 :
   1. 50 ML 원뿔에 주입 모세 혈관을 놓고튜브 및 여과 메탄올 / 염산 (9:1)로 50 ㎖를 추가합니다. 잘 흔들어 10 시간 이상 더 이상 하룻밤 둡니다.
   2. 메탄올 / 염산을 붓고 모세 혈관 같은 튜브에 여과 메탄올로 2 배 린스.
   3. 극력 메탄올 흘려 메탄올 완전한 제거를 보장하기 위해 밤새 모세관을 냉동 건조.
3. 조심스럽게 바늘로드 홀더에 바늘 모세관을 탑재하고 microloader 팁을 사용하여 시료 용액의 <0.5 μL로로드합니다. 샘플 용액은 보통 주입 재료 ^(3)에 따라 20 %의 글리세롤을 포함한다.
4. 현미경 단계 (접안 렌즈를 통해 볼 때 계란은 수직으로 정렬되어야한다)에 저었다 계란 요리를 놓고 계란에 초점을 맞 춥니 다.
5. 정중 마이크로 인젝션 니들 홀더 상에 적재 니들 마운트 필드의 중앙에 집중된 완벽 팁을 갖도록 바늘의 위치를​​ 조정한다.
6. 최대 압력 FO을 적용 버튼을 우울R 바늘 청소. 해결 방법은 바늘에서 나오는 것이다. 필요할 경우 압력을 조절 : 사출 압력은 약 1 / 3의 사출 압력 보정 압력, 90-360 고전력 증폭기의 범위에 있어야한다.
7. 미 수정 난자에 주입하여 솔루션의 흐름을 조절합니다. 조이스틱 미세 조작기를 사용하여 난자에 주사 바늘의 선단을 연출. 바늘 항목을 촉진 이러한 스크류 드라이버와 같은 단단한 물체와 무대의 부드러운 도청에 의해 약간의 떨림을 만들 수 있습니다. 계란 내부에 형성 주입 러스 (그림 5)을 볼 수 있어야합니다.
8. 사출 알약이 표시되지 않는 경우, 약간, 계란 위의 바늘의 끝을 제기 접시에 스크래치를 찾아 필드의 중간에 위치하도록 조정합니다. 부드럽게 주사 바늘의 끝을 깰 수있는 스크래치 마크에 바늘 끝을 누릅니다. 사출 알약은 t 1 / 5을 초과하지 않도록하기 위해 주입 및 보상 압력을 조절계란 (1-2시)의 그 직경.
9. 사출 알약이 교정되면, 희석 정자 (1:1,000) 또는 정자의 1-2 μl를 추가하여 계란을 비옥. 계란의 행을 쫓아 내기 방지하기 위해주의 깊게 잘 섞는다.
10. 수정 봉투 (그림 5)으로 표시되기 직후 주사를 시작합니다. 스테이지 컨트롤러를 사용하여 저어 달걀의 선을 따라 이동하고 조이스틱 micromanipulator에 의해 제어되는 바늘을 파고하여 가능한 많은 수정란을 주입.
11. 10-15 분 후, 새롭게 수정란 경화 될 것이며, 더 이상 분사 될 수 없다. 무대에서 접시를 제거하고 조심스럽게 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 3-AT 바다 물에 정자를 대기음.
12. 접합자가 건조하게하지 마십시오. 빨리 요리를 충당하기 위해 신선한 prechilled 바다 물을 추가합니다. 15 ° C에서 배아를 품어

결과

GFP 및 mCherry 기자의 구조는 전사 새로 수정란에 미세 주입 체외에 있었다. 배아는 (blastula 단계까지) 24 시간 동안 15 ° C에서 배양 및 혈구 관찰자 Z1 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다. 기자 구조의 주입은 발달 결함으로 (그림 6)를지도하지 않았다. 형광 신호의 정량화를 들어, 이미지 수집은 최대한 형광 픽셀 (그림 6D-F)를 캡처하는 낮은 배율 (100X)에서 수행 하였다....

토론

미세 주입은 DNA, mRNA의, 재조합 단백질, 기능의 손실, 계란, 배아, 다양한 생물 ^1-7의 세포로 기능 시약, 염료 및 그 조합의 이득 등의 다양한 트리트먼트를 제공하는 강력한 기술이다. 미세 주입 실험을 설계 할 경우에는 몇 가지 고려 사항을 염두에 보관해야합니다.

그것은 전달 처리 및 주입량의 용해성을 고려하는 것이 중요하다. 미세 주입 용액은 심지어 약간 침전?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope  Axiovert 40 °C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical  needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles