Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Özet

Mikroenjeksiyon yumurtalar, embriyo ve çeşitli türlerin hücrelerine DNA yapıları, mRNA, morfolino antisens oligonükleotidler veya diğer tedaviler sunmak için kullanılan bir tekniktir.

Özet

Hücre ve embriyo mikro enjeksiyon biyolojik süreçlerin geniş bir çalışma için kullanılan yaygın bir tekniktir. Bu yöntemde, muamele çözeltisi bir miktar fiziksel olarak tek tek hareketsiz hücreler ya da embriyolar enjekte etmek için kullanılan bir mikro-enjeksiyon iğne içine yüklenir. Yüksek verimli teslimat için bu yordamı gerçekleştirmek için ilk eğitim ihtiyacına karşın, mikroenjeksiyon maksimum verimlilik ve hücreler, yumurta veya embriyo içine (numunelerinin kompleks karışımlar dahil) tedavi çözümleri geniş bir yelpazede tekrarlanabilir teslim sunuyor. Mikroenjeksiyon için Uygulamalar DNA konstruktları, mRNA, yeniden birleştirici proteinlerin, fonksiyon kazancı ve reaktiflerin işlev kaybı verilmesini içerir. Floresan boya veya kolorimetrik anlık etkili teslimat görselleştirme hem de verilen ilaç miktarının güvenilir normalizasyonu için bir araç sağlamak için enjekte edilen çözeltiye ilave edilir. Anlatılan yöntem 100-400 deniz kestanesi z mikroenjeksiyon sağlar10-15 dakika içinde ygotes.

Giriş

Verimli ve tekrarlanabilir tedavi teslim araştırmacılar için temel metodolojik zorluklardan biridir. Çeşitli yöntemler geçici yumurta, embriyo ve hücre içine tedavi çözümleri sunmak için kurulmuştur. Bu yöntemler, ^1,2, lipofeksiyon (membran ile muamele ihtiva eden lipozomların füzyon yoluyla teslim) ^1, mikropartikül bombardımanı ¹ (DNA mikron çökeltilir (kısa elektrik darbeleri kullanılarak membran içine bir üreten geçici gözenekler göre) elektroporasyonu ölçekli metal daha sonra yüksek hızda hücrelere nüfuz için kullanılan parçacıklar) ve transdüksiyon (virüs transgenlerin bir iletim aracı olarak kullanılır). Şu anda, mikroenjeksiyon minimal reaktifler ile% 100 verim ile herhangi bir çözüm sunma avantajına sahip tek yaklaşımdır. Ayrıca, tek bir enjeksiyon çözeltisi tedaviler karmaşık bir kokteyli imal edilebilir. Bu teknik, başarılı için kullanılmıştırly örneğin deniz kestanesi ^3,4, zebra balığı ^{5, 6} fare, kurbağa ^{7, 8} ve sığır hem de doku kültürü ⁹ tek hücreleri gibi çok sayıda türden yumurta ve embriyolar Microinject. Sonraki gelişim aşamalarında tek blastomerler enjeksiyonları da ^10-12 yapılmıştır.

Microinjections güncel yöntem başlangıçta Hiramoto ¹⁰ tarafından tarif edilmiştir basınçlı enjeksiyon yöntemine dayalı, ancak büyük ilerleme bu sürecin optimizasyonu doğru yapılmıştır. Mükemmel mikroenjeksiyon teknikleri yerde ¹¹ tarif edilmiştir, ve burada şu anda deniz kestanesi (Strongylocentrotus purpuratus) yeni döllenmiş yumurta Microinject için kullanılan özel yöntemler birini açıklar. Bir yüzyılı aşkın süredir, deniz kestanesi değerli bir deneysel model ^15,16 olmuştur. Deniz kestaneleri evrimsel yakından (bize dahil) omurgalılar ve analizi ile ilgiliBu genom, insan ¹⁷ gibi tüm ana gen aileleri içerdiğini ortaya koymuştur. Bunlar, senkron olarak kolayca manipüle edilebilir şeffaf embriyo geliştirme, çok sayıda üretir. Bir model organizma olarak deniz kestanesi kullanarak, deniz kestanesi Topluluğumuza döllenme süreci anlayış ^18-21, hücre biyolojik süreçler ^22-24, ve gen düzenleyici ağlar (GRNs) ^25-28 katkıda bulunmuştur.

Deniz kestanesi zigot içine mikroenjeksiyon birkaç adım gerektirir. İlk olarak, yumurta önce (aşağıda tarif edilmiştir) enjeksiyonu için hareketsiz olması gerekir. Mikroenjeksiyon yemekler negatif yüklü yumurta ³ yapışabildiği bir pozitif yüklü yüzey oluşturur protamin sülfat (PS) ile kaplanır. Yumurtalar, doğal veya yapay deniz suyu, deniz suyu (pH 8.0) içinde iki yıkama ve ardından, 10 dakika boyunca asidik deniz suyu içinde inkübe (pH 5.15) ile dejellied edilir. Dejellied yumurta dikkatli bir çizgide küreklidöllenme ²⁹ bir sonucu olarak yumurtanın kortikal granüllerden salgılanan ovoperoxidase aktivitesini inhibe etmek için gerekli olan 1 mM 3-aminotriazolün (3-AT), varlığında, PS kaplı çanak ortasında. Bu adım, döllenme zarfın sertleşmesini önlemek ve mikro-enjeksiyon iğne girişi kolaylaştırmak için önemlidir. 1 mM 3-AT bir alternatif olarak, 10 mM paraminobenzoic asit (PABA) kullanılabilir. Enjeksiyon çözeltisi özel bir microloading pipet kullanarak mikro-enjeksiyon iğne içine yüklendi ve mikromanipülatör ve baskı ünitesine bağlı bir tutacak (Şekil 1) üzerine monte edilir. Her iğne ayrı günlerde çok deneylerde tek zigotların Microinject için kullanılabilir. Zigotlar sertleşmesine kadar Mikroenjeksiyon 10-15 dakika boyunca gerçekleştirilebilir. Zigotlar daha sonra 15 ° C'de deniz suyu ile yıkanır ve kültüre Embriyolar blastula aşamasına kuluçka ulaştıklarında, fer bileşenlerini sindirir kuluçka enzim serbesttilization zarf ³⁰ ve onları doğal PS-kaplı çanak ayırmak için izin verir. Gerekirse, embriyolar hafifçe aşağı embriyoların üzerine deniz suyu üflenerek bir ağız pipet veya Pasteur pipeti kullanılarak tabaktan sökülebilmektedir. Tarif edilen yöntem, alt analizler için yüksek verimli bir yöntem sağlayarak, tek bir tabak üzerinde 100-400 yeni döllenmiş yumurta etkin ve güvenilir bir mikroenjeksiyon sağlar.

Protokol

1.. Protamin sülfatın hazırlanışı (PS) Züccaciye Kaplı

1. 50 ml konik bir tüp içinde, deiyonize damıtılmış su (GKD ₂ O), 50 ml PS 0.5 g eklenmesi ile protamin sülfat (PS)% 1 çözeltisi hazırlayın. PS tam olarak çözünmesini sağlamak için 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında bir tezgah bir karıştırıcı üzerinde yüksek hızda iyice çalkalayın. Bu çözelti, (tam olarak, her kullanım öncesi jel benzeri bir çökeltinin çözünmesi için emin olun) ^3, en az 3 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
2. 60 mm x 15 mm polistren Petri yemekleri bir kol alın ve bankta hem kapaklarını ve dipleri yatıyordu.
3. En az 2 dakika boyunca bırakın, yüzeyini kaplamak için yeterli her yemeğin içinde% 1 PS solüsyonu (hem dipleri ve kapaklar kullanılır) dökün. 4 ° C 'de muhafaza edildiğinde, geri kalan çözelti, PS 3 ay içinde bir çok kez tekrar edilebilir
4. Yer, damıtılmış su (dH ₂ O) ile dolu bir beher içinde yemekler PS-işlemden geçirildi. Için dH ₂ O çalıştıran altında beher bırakın en azından10 dk.
5. PS kaplı yemekler depolama için hemen veya hava kuru kullanılabilir. Toz birikmesini önlemek için onları kapsar. Bunlar, 1 ay ³ oda sıcaklığında saklanabilir.

2. Deniz Kestanesi gamet elde etmek ve Mikroenjeksiyon için bir PS kaplı çanak üzerinde Yumurta hareketsiz

1. Garnetleri ³ (Şekil 2) serbest bırakmak için düz kasların kasılmasını uyardığı sallayarak ya da% 0.5 KCl kadar 1 ml intracoelomic enjeksiyonu ile Spawn deniz kestanesi.
2. Hayvan bir erkek ise, beyaz renk sperm ile gösterildiği gibi, 1.5 ml tüp içine bir hayvanın yüzeyinden sperm kuru toplar. Kuru sperm biyolojik fonksiyon kaybı olmadan bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
3. Hayvan nedeniyle yumurta sarısı içeriğine sarı renk ile gösterildiği gibi, bir kadın, deniz suyu ile dolu bir beher içinde gonopores daldırma tarafından gamet toplamak değilse. Yumurta gonopores salınır ve yerçekimi tarafından aşağı yerleşmek olacaktır.
4. Enkaz böyle 80 mikron naylon örgü filtre kullanılarak hayvan dikenler gibi yumurta Filtre. Yumurta yumurtlama sonra 5-7 saat içinde kullanılması halinde iyi sonuçlar elde edilir.
5. Yumurta Dejelly:
   1. Yumurtanın yaklaşık olarak 1 ml asitli deniz suyu 100 ml hazırlayın. 5,1-5,2, pH 8.0 deniz suyunun pH değerini ayarlamak için, 0.5 M sitrik asit kullanın. Bir pH değerinde çok düşük döllenme azalacak ve bir pH çok yüksek yumurta PS kaplı plakalara takmak için izin vermez.
   2. Asidik deniz suyuna yumurta (en fazla 1 mi) ilave edin ve yumurta 10 dakika boyunca buz üzerinde yerleşmek için izin verir. Seçenek olarak ise, jöle kat çıkarılması tedavi sırasında yumurta Hafifçe girdapladıktan kolaylaştırılabilir. Bir 3-4 dakika içinde etkili dejelly bu şekilde S. purpuratus yumurta yapabilirsiniz.
   3. Dikkatle, asitli deniz suyu dökün taze deniz suyu ekleyin ve yumurta buz üzerinde yeniden yerleşmek edelim. Dejellied yumurta gübreleme sorunsuz kadar 6 saat boyunca buz üzerinde saklanabilir

3. Yumurta Row

1. GKD ₂ O., 10 ml 3-AT 0.84 g çözülerek 3-aminotriazol (3-N, MW = 84,08) içinde 1 M stok çözelti hazırlayın Bu çözüm, en fazla 6 ay için 4 ° C'de saklanabilir.
2. Önceden soğutulmuş deniz suyunun 50 ml 1 M stok çözeltisinden 50 ul ekleyerek 3-AT 1 mM'lik çalışma çözeltisi hazırlayın. Buz üzerinde çözüm tutun.
3. Yumurta yumuşak kullanım için ağız pipet (Şekil 3) hazırlayın:
   1. Pipet manuel cam mikropipetler (100 x 1.09 mm OD) çekilir. Açık alev üzerinde iki elinizle mikropipet tutun. Cam erimeye başladığında, dikkatli bir şekilde karşı doğrultularda pipet uçları çekin.
   2. Parafilm ile sızdırmaz bir mühür, bir plastik boru (ID 1.14 mm) bir pipet çekilmiş bağlayın. Borunun uzunluğu yaklaşık 50-70 cm olmalıdır.
   3. Için cam boru için tüp ters sonunda steril filtre edilmiş P20 veya P200 ucu takınağız parçası olarak kullanılabilir.
   4. Ucun çapını ayarlamak için makas ile cam mikropipet ucunu Klip. Optimal çapı hafifçe yumurta (80 um) çapını aşmaktadır.
4. Her PS kaplı tabak (taban veya kapak) içine 1 mM 3-AT deniz suyu 4 ml dökün.
5. , Ağız pipet al ağzına P20/P200 ucu koymak ve dişleri ile sabitleyin. Yumurta aspire için, ilk olarak deniz suyu, az miktarda aspire. Önce yumurta yükleme için bir sıvı sütunu sahip olarak, tek ağız pipetleme tekniği üzerinde maksimum kontrole sahip olacak.
6. Yumurta yakın mikropipet ucu yerleştirin ve yavaşça pipet yumurta birkaç yüzlerce aspire. Cam mikropipet içinde yumurta hapsedin.
7. Satır düz bir çizgi ucu hareket ederken yavaşça ağız pipet onları üfleme bir yemeğin üzerine düz bir çizgide yumurta dejellied. Döllenme sorunları nedeniyle p oluşabilir, çünkü sağ enjeksiyonlar önce yumurta Row3-AT deniz suyu ³ maruz rolonged. Ayrıca, PS gibi katyonik yapıştırıcılar yumurta için toksik olabilir, ve gübreleme zarflar kaldırılmış, özellikle uzun süre bu reaktiflerin embriyo maruz için tavsiye edilmez.
8. Cam bir pipet kullanarak sıralı yumurta çizgiye yakın yemeğin üzerine bir çizik yapın. Bu çizik gerektiği gibi çözümün akışını ayarlamak için enjeksiyon iğnesi kırmak için önemli olacaktır. Alternatif olarak, çizik çanak 3-AT deniz suyu dökme önce yapılabilir.

4. Deniz Kestanesi Zigotlar Mikroenjeksiyon

1. Mikroenjeksiyon istasyonu açmak. Burada FemtoJet enjeksiyon sisteminin kullanımı açıklanmaktadır.
2. Bir iğne çektirmenin kullanarak enjeksiyon kılcal damarları çekin. İyi bir iğnenin bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir. Not: RNA enjeksiyonlar için, kılcal kısımların enjeksiyon RNAaz kirlenmesini önlemek için ³¹ ön-muamele edilmelidir:
   1. 50 ml konik içine enjeksiyon kılcal damarları yerleştirinborular ve süzüldü, metanol / HCI (9:1) 50 ml. İyice çalkalayın ve 10 saat daha uzun bir gece bekletin.
   2. Metanol / HCl dökün ve kılcal damarlar aynı tüp içerisinde, süzüldü, metanol ile 2x yıkayın.
   3. Mümkün olduğu kadar metanol süzün ve metanol içinde tamamen çıkarılmasını sağlamak üzere bir gece boyunca liyofilize kılcal.
3. Dikkatli bir iğne yükleme tutucu üzerine iğne kılcal montaj ve Microloader ipuçlarını kullanarak bir örnek çözeltisi <0.5 ul ile yükleyebilirsiniz. Örnek çözeltiler genellikle enjekte edilen malzemenin ³ bağlı olarak,% 20 gliserol ihtiva etmektedir.
4. Mikroskop aşamasında (Gözmerceklerinden bakıldığında yumurta dikey olarak aynı hizada olmalıdır) rowed yumurta çanak yerleştirin ve yumurta odaklanın.
5. Dikkatlice iğne microinjecting sahibinin üzerine yüklenen iğne montaj ve alanın ortasında mükemmel odaklanmış ipucu var iğnenin konumunu ayarlamak.
6. Maksimum basıncı fo uygulamak için düğmeye basınızr iğne temizleme. Çözüm iğne çıkması gerekir. Gerekirse, basıncı ayarlamak için: enjeksiyon basıncı, yaklaşık 1/3, enjeksiyon basıncı dengeleme basıncı ile, 90-360 hPa aralığında olmalıdır.
7. Döllenmemiş yumurtanın içine enjekte edilerek çözelti akışını ayarlayın. Bir joystick micromanipulator kullanarak, döllenmemiş yumurta enjeksiyon iğne ucu doğrudan. , Iğne girişini kolaylaştıracak böyle bir tornavida gibi sert bir cisimle aşamasında nazik dokunarak hafif titriyordu oluşturmak için. Yumurta içinde şekillendirme bir bolus enjeksiyon (Şekil 5) görülmelidir.
8. Enjeksiyon iri hap şeklinde görünür değilse, hafif, yumurtaların yukarıdaki iğne ucu yükseltmek yemeğin üzerinde çizik bulmak ve alanın ortasında yer şekilde ayarlamak. Yavaşça bir iğne ucu kırmak için karalama işaretine iğne ucu dokunun. Enjeksiyon bolus t 1/5 aşmamasını sağlamak için enjeksiyon ve tazminat basınçları ayarlayınyumurta (1-2 pm) ve o çapı.
9. Enjeksiyonu bolus kalibre edildikten sonra, sulandırılmış sperm (1:1,000) veya sperm 1-2 ul ekleyerek yumurtaları döller. Yumurta satır yerinden oynatmamaya önlemek için dikkatli bir şekilde iyice karıştırın.
10. Fertilizasyon zarf (Şekil 5) görünür hale gelir hemen sonra enjeksiyonları başlayın. Sahne denetleyicisi kullanarak sıralı yumurta hattı boyunca hareket ve joystick micromanipulator tarafından kontrol iğne ile alay ederek mümkün olduğunca çok sayıda zigot enjekte.
11. 10-15 dakika sonra, yeni döllenmiş yumurta sertleştirilmiş olacaktır ve herhangi bir daha fazla enjekte edilebilir olamaz. Aşamasından çanak çıkarın ve dikkatli bir plastik Pasteur pipet kullanarak 3-AT deniz suyunda sperm dışarı aspire.
12. Zigot kuru izin vermeyin. Çabuk çanak kapağı taze önceden soğutulmuş deniz suyu ekleyin. 15 ° C de inkübe embriyolar

Sonuçlar

GFP ve MCherry raportör transkribe yapıları ve yeni döllenmiş yumurtalar içine mikro-enjekte in vitro idi. Embriyolar (Blastula aşamasına kadar), 24 saat boyunca 15 ° C'de inkübe edildi ve Zeiss Observer Z1 mikroskop kullanılarak görüntülendi. Raportör yapılan enjeksiyon herhangi gelişim kusurları (Şekil 6) yol vermedi. Floresan sinyallerin ölçümü için, görüntü alma maksimum floresan piksel (Şekil 6D-F) yakalamak için düşük büyütme (100X) g...

Tartışmalar

Mikroenjeksiyon DNA, mRNA, yeniden birleştirici proteinlerin, fonksiyon kaybı ve yumurta, embriyo ve çeşitli organizmaların ^1-7 hücrelerine fonksiyonu reaktifler, boyalar ve bunların kombinasyonları gibi çeşitli tedaviler kazancı sağlanması için güçlü bir tekniktir. Mikroenjeksiyon deney tasarımı Ancak, bazı noktalar akılda tutulmalıdır.

Bu teslim tedavi ve enjeksiyon hacminin çözünürlüğünü dikkate almak çok önemlidir. Microinjected çözüm bile h...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope  Axiovert 40 °C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical  needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles