התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Summary

Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים.

Abstract

Microinjection לתוך תאים ועוברים הוא טכניקה נפוצה המשמשת ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. בשיטה זו כמות קטנה של פתרון טיפול הוא נטען לתוך מחט microinjection המשמש להזריק פיזי תאים בודדים משותקים או עוברים. למרות הצורך בהכשרה ראשונית לביצוע הליך זה למסירת תפוקה גבוהה, microinjection מציע יעילות מרבית ומשלוח לשחזור של מגוון רחב של פתרונות לטיפול (כולל תערובות מורכבות של דגימות) לתאים, ביצים או עוברים. יישומים לmicroinjections כוללים משלוח של בונה DNA, mRNAs, חלבונים רקומביננטיים, רווח של פונקציה, ואובדן של חומרים כימיים פונקציה. צבע פלואורסצנטי או colorimetric מתווסף לפתרון המוזרק כדי לאפשר הדמיה מיידית של אספקה ​​יעילה, כמו גם כלי לנורמליזציה אמינה של כמות הפתרון נמסר. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection של z קיפודי הים 100-400ygotes בתוך 10-15 דקות.

Introduction

משלוח טיפול יעיל לשחזור הוא אחד האתגרים מתודולוגיים העיקריים לחוקרים. מספר שיטות הוקמו כדי לספק transiently פתרונות טיפול לביצים, עוברים, ותאים. שיטות אלה כוללות electroporation (המבוסס על הנקבוביות חולפות הניבו בקרום באמצעות פולסים חשמליים קצרים) ^1,2, lipofection (משלוח באמצעות השילוב של יפוזומים המכיל טיפול עם הקרום) ^1, הפגזת microparticle ¹ (DNA הוא זירז במיקרון חלקיקים בגודל מתכת המשמשים לאחר מכן לחדור לתאים במהירות גבוהה), ותמרה (וירוס משמש ככלי מסירה של transgenes). כרגע, microinjection הוא הגישה היחידה שמחזיקה את היתרון של מתן כל פתרון עם יעילות 100% עם ריאגנטים מינימאליים. יתר על כן, פתרון זריקה אחת יכול להיות מורכב מקוקטייל מורכב של טיפולים. טכניקה זו נעשתה שימוש כדי להצליחly microinject הביצים ועוברים ממספר רב של מינים כמו קיפודי ים ^3,4, דגי זברה ^5, עכבר ^6, צפרדע ^7, ובקר ^8, כמו גם תאים בודדים בתרבית רקמת ^9. זריקות לסטומרים יחיד בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר גם נערכו ^10-12.

השיטות הנוכחיות של microinjections מבוססות על שיטת לחץ ההזרקה שהיה בתחילה שתוארה על ידי Hiramoto ^10, עם זאת, התקדמות רבה נעשתה לקראת אופטימיזציה של התהליך הזה. טכניקות microinjection מצוינות כבר תיארו במקום אחר ^11, וכאן אנו מתארים באחת מהשיטות הספציפיות המשמשת כיום לmicroinject קיפודי ים (purpuratus Strongylocentrotus) ביצים מופרות חדש. במשך יותר ממאה, קיפודי ים היו ^15,16 מודל ניסיון יקר ערך. קיפודי ים קשורים באופן הדוק לאבולוציונית chordates (כולל אותנו) וניתוח שלהגנום שלהם גילה כי הם מכילים את כל משפחות גנים גדולות ^כ17 האנושיים. הם מייצרים מספר גדול של סינכרוני פיתוח עוברים שקופים שניתן להשפיע בקלות. השימוש בקיפוד ים כאורגניזם מודל, קהילת קיפודי הים תרמה להבנתנו את תהליך ההפריה ^18-21, תהליכים ביולוגיים תא ^22-24, ורשתות גנים רגולטוריים (GRNs) ^25-28.

Microinjection לzygotes קיפודי הים דורש מספר שלבים. ראשית, את הביצים צריכה להיות משותקת לפני זריקות (שיפורט להלן). מנות Microinjection הם מצופים סולפט protamine (PS), אשר יוצר משטח חיובי טיעונים שלביצים טעונות השלילי יכולה לדבוק ^3. הביצים dejellied על ידי דגירה במי ים חומצי (pH 5.15) עבור 10 דקות, ואחרי שתי שטיפות במי ים טבעיים או מים מלאכותיים ים (pH 8.0). ביצי dejellied הם חתרו בזהירות בקו ישרבאמצע הצלחת מצופה נ.ב. בנוכחות 1 מ"מ 3-aminotriazole (3-AT), אשר נדרש כדי לעכב את הפעילות של ovoperoxidase שמופרש מהגרגרים בקליפת המוח של הביצה כתוצאה מההפריה ^29. שלב זה חשוב כדי למנוע התקשות של מעטפת ההפריה וכדי להקל על כניסת מחט microinjection. כחלופה ל1 מ"מ 3-AT, חומצת 10 מ"מ paraminobenzoic (PABA) יכולה לשמש. פתרון ההזרקה הוא נטען לתוך מחט microinjection באמצעות פיפטה קצה microloading מיוחד ורכוב על בעל המצורף לmicromanipulator ויחידת לחץ (איור 1). כל מחט יכולה לשמש כדי microinject zygotes הבודד בניסויים מרובים בימים נפרדים. Microinjection יכול להתבצע ל10-15 דקות, עד zygotes להתקשות. אז zygotes נשטפים עם מי הים ותרבותי ב15 ° C. כאשר העוברים להגיע בקיעת blastula במה, הם משחררים אנזים בקיעה שמעכל רכיבים של ferמעטפת tilization ³⁰ ולאפשר להם להתנתק באופן טבעי מהצלחת המצופה PS. במידת צורך, את העוברים ניתן עדינות מנותקת מהצלחת בעזרת פיפטה פה או פיפטה פסטר בעדינות על ידי נושבת מי ים על העוברים. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection יעיל ואמין של 100-400 ביצים מופרות חדש על צלחת אחת, ומספקת שיטת תפוקה גבוהה עבור ניתוחים במורד הזרם.

Protocol

1. הכנת protamine סולפט (PS) מצופה צלחות

1. הכן פתרון 1% מסולפט protamine (PS) על ידי הוספת 0.5 גרם של PS ל50 מיליליטר מים deionized, מזוקקים (DDH ₂ O) בצינור חרוטי 50 מיליליטר. לנער היטב במהירות גבוהה על שייקר ספסל בטמפרטורת חדר למשך 1-2 שעות כדי להבטיח פירוק של PS מלא. פתרון זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות 3 חודשים (הקפד לפזר משקע כמו ג'ל לגמרי לפני כל שימוש) ^3.
2. קח את השרוול של צלחות פטרי קלקר x 15 מ"מ 60 מ"מ ולהניח את שני מכסים ובתחתית על הספסל.
3. יוצקים 1% פתרון נ.ב. בכל מנה (יכולים לשמש גם תחתית ומכסים) רק מספיק כדי לכסות את פני השטח, להשאיר למשך לפחות 2 דקות. פתרון PS השאריות ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים רבות תוך 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים ב 4 ° C.
4. מקום שטופלה PS מנות בכוס מלאה במים מזוקקים (DH ₂ O). השאר את הכוס תחת זרם DH ₂ O לפחות10 דקות.
5. ניתן להשתמש בו מנות מצופים נ.ב. מייד או אוויר יבש לאחסון. לכסות אותם כדי למנוע הצטברות אבק. הם יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר למשך 1 חודש ^3.

2. השג תאי המין של קיפוד ים ולשתק את הביצים על צלחת מצופה נ.ב. לMicroinjection

1. קיפודי ים שרצים על ידי טלטול או הזרקת intracoelomic של עד 1 מיליליטר של .0.5% KCl כדי לגרום להתכווצות של שרירים חלקים כדי לשחרר תאי רבייה ³ (איור 2).
2. אם בעל החיים הוא גברי, כפי שצוין על ידי הזרע בצבע הלבן, לאסוף יבש זרע מפני שטח של בעלי חיים לתוך צינור 1.5 מיליליטר. זרע יבש יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע ללא אובדן משמעותי של תפקוד ביולוגי.
3. אם בעל החיים הוא נקבה, כפי שצוינה על ידי הצבע הצהוב בשל תוכן חלמון הביצה, לאסוף תאי הרבייה שלה על ידי טבילת gonopores בכוס מלאה במי ים. הביצים תשוחרר מgonopores ולהתיישב על ידי כוח הכבידה.
4. סנן את הביצים מפסולת כגון עמוד השדרה של בעלי חיים באמצעות 80 מסנן רשת ניילון מיקרומטר. התוצאות הטובות ביותר מושגות אם הביצים נמצאות בשימוש בתוך 5-7 שעות לאחר ההשרצה.
5. Dejelly ביצים:
   1. הכן מי ים חומצי 100 מיליליטר כ 1 מיליליטר של ביצה. השתמש בחומצת לימון 0.5 M כדי להתאים את pH של מי ים מpH 8.0 ל5.1-5.2. נמוך מדי של pH יקטן הפריה וגבוהה מדי של ה-pH לא יאפשר ביצים לצרף צלחות נ.ב. מצופים.
   2. מוסיף את הביצים (יותר מ 1 מיליליטר לא) למים ים חומצי ולאפשר את הביצים להתיישב על קרח דק 10. לחלופין, הסרת מעיל הריבה ניתן להקל על ידי מתערבל עדין של הביצים בזמן הטיפול. אחד יכול למעשה dejelly ביצי purpuratus ס ב3-4 דק 'בדרך זו.
   3. יוצק בזהירות את מים לים חומצי, מוסיף מים ים טריים ולתת את הביצים להתיישב על קרח שוב. ניתן לאחסן ביצי Dejellied על קרח לתקופה של עד 6 שעות ללא בעיות הפריה

3. בשורה הביצים

1. הכן 1 פתרון M המניה של 3-aminotriazole (3-AT, MW = 84.08) על ידי המסת 0.84 גרם של 3-AT ב10 מיליליטר של DDH ₂ O. פתרון זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
2. הכן 1 פתרון עובד מ"מ של 3-AT ידי הוספת 50 μl של פתרון M המניה 1 50 מיליליטר של מי ים prechilled. שמור את הפתרון על קרח.
3. הכן את הפה פיפטה (איור 3) לטיפול עדין של הביצים:
   1. קצה פיפטה הוא משך באופן ידני מmicropipettes הזכוכית (100 x OD 1.09 מ"מ). החזק את micropipette בשתי הידיים מעל הלהבה הפתוחה. כזכוכית מתחילה להתמוסס, למשוך בזהירות את הקצוות של פיפטה בכיוונים מנוגדים.
   2. חבר את אחד משך את פיפטה לצינורות פלסטיק (מ"מ 1.14 ID), חותם חזק עם Parafilm. אורכו של הצינור צריך להיות כ 50-70 סנטימטר.
   3. הכנס קצה P20 או P200 מסונן סטרילי בסוף ההפך הצינור לצינור הזכוכית כדילשמש כחתיכת הפה.
   4. קליפ סוף micropipette הזכוכית עם מספריים כדי להתאים את הקוטר של הקצה. הקוטר האופטימלי מעט עולה על הקוטר של הביצה (80 מיקרומטר).
4. יוצקים 4 מיליליטר של מ"מ המים ים 3-AT 1 לכל מנה מצופה PS (תחתון או מכסה).
5. קח את פיפטה בפה, לשים את קצה P20/P200 בפה ולאבטח אותו עם השיניים. כדי לשאוב את הביצים, לשאוב ראשון כמות קטנה של מי ים. על ידי בעל טור של נוזל לפני טעינת הביצים, תהיה אחד שליטה מקסימלי על טכניקת pipetting פה.
6. מקם את קצה micropipette ליד הביצים ולשאוב בעדינות בכמה מאות ביצים בפיפטה. להגביל את הביצים בתוך micropipette הזכוכית.
7. שורת dejellied ביצים בקו ישר על צלחת בעדינות על ידי נושבת אותם מחוץ לפיפטה הפה תוך כדי התנועה את הקצה בקו ישר. בשורה הביצים ממש לפני הזריקות, בגלל בעיות הפריה עלולות להתרחש בשל prolonged חשיפה למים ים 3-AT ^3. יתר על כן, דבקי קטיוני כמו PS יכולים להיות רעילים לביצים, וזה לא מומלץ לחשוף את העוברים לריאגנטים אלה לתקופות ארוכות, במיוחד אם את מעטפות ההפריה הוסרו.
8. הפוך שריטה על הצלחת ליד הקו של ביצים חתרו באמצעות פיפטה מזכוכית. שריטה זה תהיה חשוב כדי לשבור את מחט הזריקה כדי להתאים את הזרימה של פתרון בהתאם לצורך. לחלופין, השריטות יכולות להתבצע לפני מזיגת מים לים 3-AT למנה.

4. Microinjection של zygotes קיפודי הים

1. הפעל תחנת microinjection. כאן אנו מתארים את השימוש במערכת הזרקת Femtojet.
2. משוך נימי הזרקה באמצעות חולץ מחט. דוגמא של מחט טובה מתוארת באיור 4. הערה: לקבלת זריקות RNA, צריכים להיות pretreated נימי הזרקה כדי למנוע זיהום RNAase ^{יום 31:}
   1. הנח נימי הזרקה לתוך 50 חרוטי מיליליטרצינורות ולהוסיף 50 מיליליטר של מסונן מתנול / HCl (09:01). לנער היטב ולהשאיר למשך הלילה לא יותר מ10 שעה.
   2. יוצקים את מתנול / HCl ולשטוף את הנימים 2x עם מתנול המסונן באותו הצינור.
   3. מסננים מתנול ככל האפשר וLyophilize נימי לילה על מנת להבטיח הסרת מלאה מתנול.
3. הר בזהירות את נימי מחט על בעל טעינת מחט ולטעון אותו עם <0.5 μl של פתרון מדגם באמצעות טיפים microloader. פתרונות לדוגמא בדרך כלל מכילים גליצרול 20%, תלוי בחומר המוזרק ^3.
4. מניחים את הצלחת עם ביצים חתרו על הבמה מיקרוסקופ (צריכים להיות מיושרות ביצים אנכית כאשר נצפים מבעד עיניות) ולהתמקד בביצים.
5. הר בזהירות את המחט הועמסה על בעל microinjecting המחט ולהתאים את המיקום של המחט ליש קצה בצורה מושלמת ממוקד באמצע השדה.
6. ללחוץ על הלחצן כדי להחיל את הלחץ המקסימאלי עבורr ניקוי מחט. פתרון צריך לבוא מתוך המחט. התאם את הלחץ במידת צורך: לחץ הזרקה צריך להיות בטווח של 90-360 hPa, עם לחץ הפיצוי על כ 1/3 מלחץ ההזרקה.
7. להתאים את זרימת הפתרון על ידי הזרקה לתוך ביצית מופרה. באמצעות micromanipulator ג'ויסטיק, לכוון את קצה המחט להזרקה לביצית מופרה. כדי להקל על כניסת מחט, ליצור רעידות קלות על ידי הקשה עדינה של הבמה עם חפץ קשה כגון מברג. בולוס הזרקה להרכיב בתוך הביצה יש לראות (איור 5).
8. אם בולוס ההזרקה אינו גלוי, מעט להעלות את קצה המחט מעל הביצים, לאתר את השריטה על הצלחת ולהתאים אותו להיות ממוקם באמצע השדה. לטפוח בעדינות את קצה המחט לסימן השריטה לשבור את קצה מחט הזריקה. התאם את לחצי הזרקה ופיצוי על מנת להבטיח כי בולוס ההזרקה אינו עולה על 1/5 של tהוא הקוטר של הביצה (1-2 בערב).
9. ברגע שבולוס ההזרקה מכויל, להפרות את הביצים על ידי הוספת זרע מדולל (1:1,000) או 1-2 μl של זרע. מערבבים היטב בזהירות כדי למנוע פירוק השורה של ביצים.
10. להתחיל זריקות מייד לאחר מעטפת ההפריה הופכת לגלויה (איור 5). תנוע לאורך הקו של ביצים חתרו שימוש בבקר הבמה ולהזריק zygotes רבים ככל האפשר על ידי תוקע אותם עם המחט נשלטת על ידי micromanipulator ג'ויסטיק.
11. אחרי 10-15 דקות, הביצים המופרות החדש תהפוך קשוחות ולא ניתן להזריק יותר. מוציא את המאפה מהבמה ובזהירות לשאוב את הזרע במי ים 3-AT באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק.
12. אל תתנו zygotes יבש. להוסיף במהירות במי ים prechilled טריים כדי לכסות את המנה. דגירה את העוברים ב15 ° C.

תוצאות

בונה כתב ה-GFP וmCherry היתה במבחנה עיבד וmicroinjected לביצים מופרים שזה עתה. עוברים הודגרו ב15 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות (עד שלב blastula) והדמיה באמצעות מיקרוסקופ Zeiss אובזרוור Z1. הזרקה של מבני כתב לא הביאה לכל ליקויים התפתחותיים (איור 6). לכימות של אותות ניאון, רכישת תמונ...

Discussion

Microinjection הוא טכניקה רבת עוצמה להעברת טיפולים שונים כגון DNA, mRNA, חלבונים רקומביננטיים, אובדן התפקוד ורווח של חומרים כימיים פונקציה, צבעים ושילובים שלהם לביציות, עובר, ותאים של אורגניזמים שונים ^1-7. עם זאת, צריכים להיות כל הזמן כמה שיקולים בחשבון בעת ​​תכנון ניסוי mi...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope  Axiovert 40 °C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical  needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles