عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Summary

وقد وضعنا رواية وتقنية استنساخه لعزل الثقافات الأولية من الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء (PASMC) من الفئران في سن P7، مما يتيح دراسة أفضل للمسارات الإشارات المشاركة في حديثي الولادة العضلات الملساء انكماش الخلايا والاسترخاء.

Abstract

ارتفاع ضغط الدم الرئوي هو سبب كبير من المراضة والوفيات عند الأطفال الرضع. تاريخيا، كانت هناك دراسة كبيرة من مسارات الإشارات المشاركة في الأوعية الدموية تقلص العضلات الملساء في PASMC من الأغنام الجنين. بينما الأغنام جعل نموذجا ممتازا من ارتفاع ضغط الدم الرئوي المدى، أنها مكلفة للغاية وتفتقر إلى الاستفادة من التلاعب الوراثي الموجود في الفئران. على العكس، كان عدم القدرة على عزل PASMC من الفئران وجود قيود كبيرة من هذا النظام. نحن هنا وصف عزلة الثقافات الأولية من الماوس PASMC من P7، P14، P21 والفئران باستخدام الاختلاف من هذه التقنية هو موضح سابقا من مارشال وآخرون. ^{ال 26} التي كانت تستخدم سابقا لعزل PASMC الفئران. هذه PASMC الفئران تمثل أداة جديدة لدراسة مسارات إشارات في فترة الوليد. لفترة وجيزة، والطين من 0.5٪ (W / V) + الاغاروز هي التي غرست جزيئات الحديد 0.5٪ في M199 سائل الإعلام في السرير الوعائي الرئوي عبر البطين الأيمن (RV). الجزيئات الحديد هي 0.2 ميكرومتر في القطر وليس يمكن أن تمر عبر السرير الشعري الرئوي. وهكذا، فإن النزل الحديد في الشرايين الرئوية الصغيرة (PA). وتضخم الرئتين مع الاغاروز، إزالتها وفصلها. يتم سحبها في الأوعية المحتوية على الحديد إلى أسفل مع المغناطيس. بعد كولاجيناز (80 U / مل) العلاج ومزيد من التفكك، يتم وضع السفن في طبق زراعة الأنسجة في M199 سائل الإعلام التي تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS)، والمضادات الحيوية (M199 وسائل الإعلام كاملة) للسماح الهجرة الخلية على طبق ثقافة . هذه لوحة من الخلايا الأولية هي مزيج من الخلايا الليفية 50-50 وPASMC. وهكذا، فإن هدم الإجراء يتكرر عدة مرات لتحقيق السكان PASMC أكثر نقاء وإزالة أي الحديد المتبقية. يتم تأكيد هوية الخلايا العضلية الملساء التي كتبها المناعية لسلسة العضلات الميوسين وdesmin.

Introduction

ارتفاع ضغط الدم الرئوي أمر طبيعي خلال الحياة داخل الرحم منذ المشيمة بمثابة الجهاز الرئيسي لتبادل الغازات ويتم توزيعها فقط 10٪ من النتاج القلبي من خلال السرير الوعائي الرئوي. في الرحم والضغوط الرئوي تشبه الضغوط النظامية نظرا لارتفاع المقاومة الوعائية الرئوية . كما تقدم الحمل، وهناك نمو سريع للسلطة الفلسطينية الصغيرة داخل الرئة، وإعداد الجنين لزيادة كبيرة في تدفق الدم الرئوي الذي يحدث عند الولادة ^1. عند فشل عملية الانتقال في الفترة المحيطة بالولادة الطبيعية لدى الرضع على المدى القريب والمدى الكامل، والنتيجة هي ارتفاع ضغط الدم الرئوي الثابتة من الأطفال حديثي الولادة (PPHN). PPHN هو متلازمة سريرية بسبب العديد من الأمراض الكامنة مختلفة. ومع ذلك، كل من هؤلاء الرضع بسمات الفسيولوجية المرضية الشائعة مثل ارتفاع المقاومة الوعائية الرئوية، نقص الأكسجة، وتحويلة من اليمين إلى اليسار من تدفق الدم عبر اتصالات الجنين المستمرة مثل القناة الشريانية أو للآمين البيضوية. PPHN يؤثر 2-6 لكل 1،000 ولادة حية وينقل مخاطر 8-10٪ من وفيات فضلا كبيرا على المدى القصير وعلى المدى الطويل ² الاعتلال. بالإضافة إلى ذلك، قد منخفضة جدا الوزن عند الولادة الخدج تطوير ارتفاع ضغط الدم الرئوي نتيجة لمرضهم الرئة الكامنة. وأمراض الرئة الكامنة الأكثر شيوعا من الأطفال الخدج هو خلل التنسج القصبي الرئوي. في حين أن المخاطر الكلية للبرميل في اليوم يرتبط مع العمر الحملي ووزن الولادة، يبقى من غير الواضح لماذا مجموعة فرعية من هؤلاء الرضع تطور ارتفاع ضغط الدم الرئوي هامة وكيفية التعامل مع هؤلاء الأطفال بشكل مناسب. النتائج السيئة، بما في ذلك الإقامة في المستشفى لفترات طويلة وزيادة معدل الوفيات، شائعة ^3-6.

تاريخيا، استخدمت الأغنام PASMC الجنين أو الخنازير PASMC الجنين من الحيوانات السليمة لدراسة مسارات الإشارات المشاركة في عملية الانتقال الأوعية الدموية الرئوية الطبيعية بعد الولادة. عادة يتم عزل هذه من الجيل الخامس المقاومة الفلسطينية منن الأغنام أو الخنازير الجنين التي يتم تسليمها والموت الرحيم قبل أي التنفس العفوي ^7-9. بالإضافة إلى ذلك، بعض المحققين عزلت والاستفادة منها PASMC من كبار السن قليلا ويتنفس بشكل عفوي الحملان والخنازير في 3 أيام، 2 أسابيع، و4 أسابيع ^10-12. وفي الآونة الأخيرة، بعض المجموعات عزلت بنجاح والاستفادة منها PASMC معزولة عن الحملان مع PPHN لدراسة خللا في مسارات إشارات في حالة المرض ^13-17. وقد أثبتت هذه الخلايا لتكون أداة قيمة لدراسة مسارات الإشارات التي تشكل عاملا حاسما في كل من الأوعية الدموية الرئوية طبيعية والمريضة على المدى القريب والبعيد. ومع ذلك، فإنها لا تعطي نظرة ثاقبة في مسارات الإشارات أثرت في الأطفال الخدج المصابين بارتفاع ضغط الدم الرئوي. كما أنها لا تسمح إمكانيات التلاعب الجيني ينظر في نماذج الماوس من المرض.

منذ فترة طويلة تستخدم الجرذان والفئران نماذج لنموذج برميل يوميا ويجري استخدامها في الآونة الأخيرة إلى نموذج HY الرئويpertension الناتجة عن برميل يوميا ^18-22. الفئران حديثي الولادة هي تحريضية للعمل مع نظرا لحجم أكبر، لكنها تعاني أيضا من عدم وجود إمكانية التعديل الوراثي. تم الحيوانات المعدلة وراثيا المستخدمة على نطاق واسع للتحقيق في الآثار المترتبة على أهداف جين معين على فسيولوجيا الحيوان كله في الفئران حديثي الولادة، ولكن حتى الآن لا أحد سبق له معزولة بنجاح PASMC من هذه الفئران الصغيرة. من خلال عزل PASMC، ويمكن الحصول على مزيد من المعلومات حول كيفية تغيير مسارات في الاستجابة للمؤثرات البيئية و / أو التعديل الوراثي وتحديدا في العضلات الشريان الرئوي على نحو سلس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تصوير الحية PASMC في الوقت الحقيقي لدراسة التغيرات السريعة في الجزيئات يشير المفتاح مثل الكالسيوم وأنواع الاكسجين التفاعلية ^23-25. وصفنا في الآونة الأخيرة عزلة الناجح لPASMC من فئران بالغة باستخدام تباين أسلوب مارشال وآخرون. ²⁶ تستخدم لعزل الفئران PASMC ^23،25،26. نحن الآن تكيفت علىتمديد الثانية هذه التقنية على الفئران الصغيرة 7-21 أيام من العمر (P7، P14، P21 و). والقيد الرئيسي لهذه التقنية الجديدة العزلة PASMC هو أنه يتطلب الفئران متعددة لتوليد خلايا كافية لإجراء التجارب وأن الخلايا تنمو ببطء شديد، والذي هو سمة من خلايا العضلات الملساء الأولية. وعلى الرغم من هذه القيود، ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب لعزل PASMC الماوس حديثي الولادة تسمح للتحقيق تعزيز مسارات الإشارات الرئيسيين المشاركين في تطوير ارتفاع ضغط الدم الرئوي، ويمثل تقدما كبيرا في هذا المجال.

Protocol

لجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان في جامعة نورث وسترن الموافقة على هذا البروتوكول.

1. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - يوم واحد

1. إعداد M199 وسائل الإعلام كاملة - ميكس 400 مل M199 مع 100 مل (تركيز النهائي = 20٪) الحرارة المعطل FBS و 5 مل (تركيز النهائي = 1٪) البنسلين / الستربتوميسين.
2. إعداد المصل الحرة M199 الإعلام - ميكس 500 مل M199 مع 5 مل (تركيز النهائي = 1٪) البنسلين / الستربتوميسين.
3. إعداد الاغاروز PA - ميكس 0.05 غ الاغاروز زائد 0.05 جزيئات الحديد غ في 10 مل العقيمة، المصل خالية M199 سائل الإعلام.
4. إعداد الرئة الاغاروز - ميكس 0.1 غ الاغاروز في 10 مل العقيمة، المصل خالية M199 سائل الإعلام.
5. إعداد كولاجيناز - كولاجيناز خلط في العقيمة، المصل خالية M199 سائل الإعلام في تركيز النهائي من 80 U / مل ثم تصفية العقيمة هذا الخليط.
6. إعداد كافة المعدات في وقت مبكر قبل القتل الرحيم الماوس.
7. مجموعة PA الاغاروز والرئة الاغاروز لغلي الحق قبل القتل الرحيم الماوس.
8. الموت ببطء الماوس في جرة مخدر مع جرعة زائدة isoflurane وتوخي الحذر وعدم السماح الماوس الجرو لتأتي في اتصال مع isoflurane و. يتم الحصول على أفضل عائد الخلية عندما يتم حصاد الخلايا مباشرة بعد الموت من أجل تجنب الجلطات الصغيرة التي تشكل في الدورة الدموية بعد الموت.
9. إزالة الماوس من جرة مخدر، وتأمين الماوس إلى لوحة التشغيل، وتعقيم الماوس، والصكوك، وقفازات مع الكحول.
10. تحميل مشرط مع شفرة وشق الماوس من الرقبة إلى البطن السفلي.
11. فتح البطن على جانب الماوس الأيسر، فضح الكلى، وقطع الشريان الكلوي للسماح الماوس ليستنزف، وبالتالي تجنب الجلطات في الأوعية الصغيرة في الرئتين.
12. استخدام مقص لقطع جنبا الى جنب مع الماوس الأيسر منالقص لفتح القفص الصدري.
13. استخدام بعناية مشرط لقطع الحجاب الحاجز في كلا الجانبين وفتح بالكامل تجويف الصدر. استخدام ملقط أو دبابيس لعقد تجويف الصدر المفتوح.
14. عصا RV مع 27 G ½ بوصة إبرة الموجهة نحو السلطة الفلسطينية ويروي RV / السلطة الفلسطينية / الرئتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة حتى تظهر الرئتين الأبيض (كل الدم يخرجوا من الدورة الدموية الرئوية). وهذا سوف يستغرق حوالي 3-5 مل من برنامج تلفزيوني اعتمادا على حجم من الفأرة. من المهم أن الدفقة الأولى لمنع تشكيل جلطة في الأوعية الرئة صغير.
15. استخدام بعناية تشريح حادة لفضح القصبة الهوائية وموضوع واحد تحت الدرز.
16. وضع أصغر ملقط تحت القصبة الهوائية للحصول على الدعم ووضع angiocatheter G 24 إلى القصبة الهوائية. وضع angiocatheter كما لو وضع IV.
17. تأمين angiocatheter في القصبة الهوائية مع خياطة الخيوط في الخطوة 1.16.
18. خذ الغليان PA الاغاروز من الماء المغلي، وعكس لتخلط جيدا. تبريد agaroSE إلى ما يقرب من درجة حرارة الجسم عن طريق يحوم على الجليد. الاغاروز يجب أن يظل في حل ولكن لا تكون ساخنة بحيث أنه سيتم تلف الخلايا من السلطة الفلسطينية.
19. عصا RV مع 27 G ½ بوصة إبرة ويروي RV / السلطة الفلسطينية / الرئتين مع السلطة الفلسطينية الاغاروز حتى تظهر الرئتين الرمادي. فإن جزيئات الحديد في الخليط الاغاروز جعل الرئتين تظهر رمادية اللون. وهذا سوف يستغرق حوالي 3-5 مل من PA الاغاروز اعتمادا على حجم من الفأرة. ومن المهم أيضا أن يذهب ببطء كما حقن سريع جدا قد يسبب الحديد لتتسرب إلى المجاري الهوائية.
20. خذ الاغاروز الرئة من الماء المغلي وعكس لتخلط جيدا. ثم تبريد الاغاروز إلى ما يقرب من درجة حرارة الجسم بواسطة يحوم على الجليد. الاغاروز يجب أن يظل في حل ولكن لا تكون ساخنة بحيث أنه سيتم تلف الخلايا في الرئة.
21. وضع الاغاروز الرئة ونعلق المحقنة إلى angiocatheter G 24 في القصبة الهوائية. لبث الاغاروز من خلال القصبة الهوائية لتضخيم تماما الرئتين. سوف الرئتين يكون easieR إلى اللحم المفروم (انظر خطوات لاحقة) إذا تضخمت بشكل مناسب الرئتين.
22. إزالة كتلة القلب والرئة، وتغمره في 25 مل من الجليد الباردة PBS ليصلب الاغاروز (~ 5 دقائق). استخدام هذا الوقت لتنظيف المنطقة الجراحية.
23. بالنسبة للفئران حديثي الولادة (P7-P21)، وأفضل عائد PASMC تأتي من الجمع بين 2-3 الجراء في دفعة واحدة من الخلايا. PASMC يفضل أن يكون على اتصال مع خلايا أخرى للصحة الخلية الأمثل والنمو. إذا تم استخدام الماوس واحد في عزلة، ثم الخلايا هي ضئيلة جدا والتي لا تنمو بشكل جيد. عند الجمع بين الحيوانات، والحصاد والبرد الكتل القلب والرئة معا ومن ثم الانتقال الى تنميق مرة واحدة وقد تم إزالة جميع الكتل القلب والرئة من الحيوانات.
24. انتقال إلى الخلية هود الثقافة للعقم من هذه النقطة فصاعدا.
25. وضع الرئتين المبردة في غطاء من سم صحن زراعة الأنسجة 10 وإزالة بعناية القلب، والغدة الصعترية، القصبة الهوائية، وأي النسيج الضام من الرئتين.
26. نقل الرئتين إلى الجزء السفلي من صحن سم زراعة الأنسجة 10وإضافة ما يقرب من 1 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني العقيمة.
27. اللحم المفروم الرئتين إلى قطع صغيرة جدا (1-2 ملم) مع 2 المشارط.
28. كسر غيض الخروج من معقمة 5 مل ماصة المصلية. ماصة مفروم الطين الرئة في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. استخدام إضافية العقيمة PBS الجليد البارد لغسل لوحة لضمان أن كل من أنسجة الرئة يحصل في مل أنبوب مخروطي 50.
29. ضع مل أنبوب مخروطي 50 على المغناطيس. انتظر الأنسجة المحتوية على الحديد للانتقال إلى الجانب من الأنبوب بجانب مغناطيس. اعتمادا على نسبة من السفينة المحتوية على الحديد إلى أنسجة الرئة، وبعض من السفن قد لا يزال يسبح في هذه المرحلة. نضح قبالة PBS ببطء وبعناية محاولة عدم نضح أنسجة الرئة العائمة نظرا لأنه غير واضح إذا كان يحتوي على السفن.
30. غسل الرئة بيليه 3x مع 5 مل العقيمة PBS، في محاولة مرة أخرى لتقليل كمية من أنسجة الرئة التي يستنشق.
31. resuspend الكرية الرئة في 3 مل كولاجيناز وتصب في صحن 60 ملم زراعة الأنسجة. لامحاولة ماصة هذا؛ فإن أجزاء الرئة العصا إلى الداخل من ماصة الخاص.
32. استخدام 3 مل إضافية لشطف الأنبوب بعد صب، وتصب هذه في 60 مم طبق زراعة الأنسجة أيضا.
33. المكان الى 37 درجة مئوية الأنسجة حاضنة الثقافة لمدة 1 ساعة.
34. الأنسجة ماصة + الطين كولاجيناز صعودا وهبوطا مع 15 G إبرة حادة على حقنة 5 مل حتى تتعطل جميع القطع الرئة كبيرة. الأنسجة + سوف يكون الطين كولاجيناز غائم في هذه المرحلة مع عدم وجود قطع الأنسجة والأجهزة المختلفه.
35. تصب العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد ونعلق على المغناطيس.
36. غسل الطبق زراعة الأنسجة مع حوالي 5 مل من اكتمال M199 سائل الإعلام لضمان أن جميع الأنسجة تم جمعها، وتصب هذه في أنبوب مخروطي الشكل.
37. نضح قبالة كولاجيناز + طاف وسائل الإعلام. هذه المرة سوف يكون هناك عدد قليل جدا من العوامات، وسوف التعاقد المحتوية على الحديد بيليه تكون على الجانب من الأنبوب المخروطية بجانب مغناطيس.
38. يغسل مع 5 مل كاملة ميدIA 3X. هذا مطلوب لإبطال نشاط كولاجيناز.
39. أضف 3 مل من وسائل الإعلام كاملة، ومزج صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend الكرية التي تحتوي على الحديد.
40. صب بيليه معلق إلى 35 مم طبق زراعة الأنسجة. باستخدام المجهر، وسيكون هناك شظايا سفينة صغيرة تطوف مع جزيئات الحديد الواردة في التجويف السفينة.
41. وضع صحن زراعة الأنسجة (المسمى لوحة صفر) في نسيج الثقافة الحاضنة بين عشية وضحاها. أول خلايا للانتقال من على لوحة صفر ما يقرب من 50٪ الخلايا الليفية و 50٪ PASMC، استنادا إلى تلطيخ لعلامات العضلات الملساء. وهذا ما يسمى لوحة صفر مطلي والتخلص منها في نهاية المطاف بعد خطوات تخصيب اللاحقة.

2. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - اليوم الثاني

1. صب سائل الإعلام طاف من لوحة صفر في نظيفة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
2. نضح قبالة طاف وسائل الإعلام. هذه المرة سيكون هناك تقريبا أي العوامات، والتعاقد الحديد كونتاسوف ining بيليه تتشكل على الجانب من الأنبوب المخروطية بجانب مغناطيس.
3. يغسل مع 5 مل وسائل الإعلام كاملة 3X.
4. أضف 3 مل من وسائل الإعلام كاملة، ومزج صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend الكرية التي تحتوي على الحديد.
5. تصب في طبق 35 ملم زراعة الأنسجة. باستخدام المجهر، وينظر إلى شظايا سفينة صغيرة تطوف مع جزيئات الحديد الواردة في التجويف السفينة. وستكون هذه لوحة واحدة (الشكل 1A).
6. وضع صحن زراعة الأنسجة في زراعة الأنسجة حاضنة.

3. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - الأيام الستة

1. صب سائل الإعلام طاف من لوحة واحدة في نظيفة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تكرار هذه الخطوة عدة مرات يؤمن بأن كل من خلايا العضلات الملساء المقيمين في جدار السفينة لديك فرصة للانتقال من على طبق من ذهب ثقافة الخلية. هناك سوف عودة تناقص مع كل خطوة أي كل لوحة لديها خلايا أقل وأقل الانضمام.
2. Refeed لوحة واحدة مع كامل M199 وسائل الإعلام، ومكان مرة أخرى في نسيج الثقافة الحاضنة.
3. نضح قبالة طاف وسائل الإعلام. هذه المرة سيكون هناك تقريبا أي العوامات، وسوف التعاقد المحتوية على الحديد بيليه تتشكل على الجانب من الأنبوب المخروطية بجانب مغناطيس.
4. يغسل مع 5 مل وسائل الإعلام كاملة 3X.
5. أضف 3 مل من وسائل الإعلام كاملة، ومزج صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend الكرية التي تحتوي على الحديد.
6. تصب في طبق 35 ملم زراعة الأنسجة. باستخدام المجهر، وينظر إلى شظايا سفينة صغيرة تطوف مع جزيئات الحديد الواردة في التجويف السفينة. وستكون هذه لوحة اثنين.
7. وضع صحن زراعة الأنسجة في زراعة الأنسجة حاضنة.

4. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - اليوم التاسع

1. صب طاف وسائل الاعلام من الطبق زراعة الأنسجة لوحة نظيفة اثنين الى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
2. لوحة Refeed اثنين مع كامل M199 وسائل الإعلام، ومكان مرة أخرى في زراعة الأنسجةالحاضنة.
3. نضح قبالة طاف وسائل الإعلام. هذه المرة سيكون هناك تقريبا أي العوامات، وسوف التعاقد المحتوية على الحديد بيليه تتشكل على الجانب من الأنبوب المخروطية بجانب مغناطيس.
4. يغسل مع 5 مل وسائل الإعلام كاملة 3X.
5. أضف 3 مل من وسائل الإعلام كاملة وخلط صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend الكرية التي تحتوي على الحديد.
6. تصب في طبق 35 ملم زراعة الأنسجة. باستخدام المجهر، وينظر إلى شظايا سفينة صغيرة تطوف مع جزيئات الحديد الواردة في التجويف السفينة. وستكون هذه لوحة ثلاثة.
7. وضع صحن زراعة الأنسجة في زراعة الأنسجة حاضنة.

5. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - ثلاثة عشر يوم

1. نضح وسائل الإعلام الخروج من لوحات 1-3.
2. غسل بلطف الخلايا مع دافئ، برنامج تلفزيوني العقيمة.
3. إضافة طبقة رقيقة من التربسين (~ 0.25-0.5 مل) التربسين إلى كل لوحة ليعرض للتريبسين خارج الخلايا. الخلايا هي ملتصقة جدا وسوف تحتاج إلى أن تكون في التربسين في cultu الأنسجةإعادة الحاضنة لمدة حوالي 10 دقيقة لرفع قبالة لوحة.
4. حصاد الخلايا قبالة لوحات إلى 5 وسائل الإعلام كاملة مل في أنبوب مخروطي 50 مل تعلق على مغناطيس لسحب أي جزيئات الحديد المتبقية.
5. غسل كل من لوحات مع 0.5 مل إضافية من وسائل الإعلام كاملة وأضيف أن وسائل الإعلام إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
6. هذه المرة، واتخاذ طاف وسائل الاعلام (لا نضح)، والتخلص من الجسيمات بيليه الحديد.
7. لوحة الخلايا في 5 مل كاملة M199 وسائل الاعلام في صحن 60 ملم لديك خلايا متكدسة في غضون أيام قليلة. بدلا من ذلك، لوحة الخلايا في 10 مل كاملة M199 سائل الإعلام في الطول لوحة 10، وPASMC سوف يستغرق ما يقرب من 1-2 أسابيع أخرى للوصول إلى نقطة التقاء.

6. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - يوم أربعة عشر

1. تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام كاملة جديدة M199 لإزالة أي التربسين المتبقية. سيكون هناك سكان رقيقة من PASMC على طبق زراعة الأنسجة (الشكل 1B).

7. الرعاية الروتينية

1. تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام كاملة جديدة M199 حوالي 2X في الأسبوع.
2. عند تقسيم هذه الخلايا، مطلوب ما يقرب من 10 دقيقة في الحاضنة في فيلم من التربسين (0.25-0.5 مل) للخلايا لرفع قبالة لوحة. باستخدام فيلم التربسين يسمح replating من PASMC دون الغزل أسفل الخلايا. إذا تم استخدام الكثير من التربسين، ثم يجب طرد في PASMC لتخرج التربسين، أو فإن الخلايا لا readhere إلى اللوحة. في بعض الأحيان، بعد الغزل أسفل الخلايا، فمن الصعب الحصول على PASMC معلق في كامل M199 سائل الإعلام.
3. في ملاحظاتها، وPASMC معزولة تتصرف مثل خلايا العضلات الملساء موثوق لمدة 4-5 الممرات، ولكن الخلايا المعزولة سيكون وصمة عار لسلسة الخلايا العضلية علامات حتى مرور 7. عد تجميع أول 60 مم أو 10 سم لوحة على ثلاثة عشر يوم ومرور 2 (الطلاء بعد أول تعرض لالتربسين).

النتائج

أثناء وبعد العزلة، ويتم فحص كل PASMC بواسطة المجهر الضوئي والمناعية لسلسة علامات الخلية العضلية. بواسطة المجهر الضوئي في البروتوكول في وقت مبكر، وينظر PASMC المهاجرة على طبق زراعة الأنسجة من الحديد الصغيرة التي تحتوي على الأوعية (الشكل 1A). بعد تجميع لوحات واحد م?...

Discussion

في هذا المخطوط، وصفنا للمرة الأولى عزلة PASMC من الفئران في P7، P14، P21 و. من أجل تحقيق هذا الهدف، وغرست في الطين من الاغاروز و 0.2 ميكرومتر جزيئات الحديد من خلال RV في السلطة الفلسطينية. ونظرا لصغر حجم جزيئات الحديد، فإنها لا يمكن أن تمر عبر السرير الشعري الرئوي، وبالتالي فهي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.